本发明专利技术涉及微生物发酵技术领域，具体涉及到一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。本申请的一种红法夫酵母菌株，命名为红法夫酵母菌株(Xanthophyllomyces dendrorhous/Phaffia rhodozyma)，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413。本发明专利技术的红法夫酵母发酵生物量干重达到110g/L，虾青素发酵产量达到600mg/L以上，虾青素含量达到5.00mg/g以上，实现红法夫酵母产业化生产虾青素，大幅超过了目前同类菌株的虾青素产量，也逐渐拉近了与基因工程菌的产量差距。本发明专利技术的红法夫酵母菌株可广泛应用于动物饲料添加剂、食品添加剂、保健品等领域。品等领域。品等领域。
【技术实现步骤摘要】
一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺
[0001]本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及到一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。
技术介绍
[0002]虾青素(Astaxanthin)，又名虾黄素，是一种萜类不饱和化合物，其化学式为3,3'
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二羟基
‑
β,β
‑
胡萝卜素
‑
4,4'
‑
二酮，分子式为C
40
H
52
O4，虾青素分子中碳原子共轭双键链的两端有不饱和羰基和羟基构成的α
‑
羟基酮结构，而α
‑
羟基酮结构具有非常活泼的电子效应，虾青素特殊的分子结构使其具有抗氧化、增强免疫、抗癌变、保护神经和心血管等生理功能；虾青素通过淬灭单线态氧、清除过氧自由基等方式阻断链式反应，抑制脂质过氧化来保护膜结构，从而起到防止氧化损伤的效果。
[0003]目前虾青素的来源主要有化学合成法、水产品加工废弃物提取和微生物高密度培养。虾青素的化学合成过程极为复杂，目前全球仅有几家企业能够自主合成并工业化生产虾青素，但在结构、功能与应用及安全性方面与天然虾青素有显著差异，化学合成的虾青素应用范围受到严格限制，尤其在食品与膳食补充剂中禁止使用。水产品加工废弃物主要来自甲壳类水产品的废弃物，由于甲壳中虾青素的含量很低，且灰分和几丁质含量较高，这在很大程度上限制了虾青素的提取效率。微生物高密度培养主要有雨生红球藻和红法夫酵母两种天然虾青素来源，前者虽然虾青素含量高，但是藻细胞生长缓慢、培养周期漫长且虾青素只能在逆境条件的胁迫下合成，在正常的生长环境下几乎不合成虾青素；需要光照而且占地面积庞大，最重要的是难以控制微生物污染藻体。红法夫酵母具备生长速度快、培养周期短、无需光照、能在发酵罐中实现高密度培养而且不限地域和气候限制，还能够利用多种糖质类作为碳源，如葡萄糖、蔗糖、纤维二糖等进行快速异养培养，但虾青素产量较低，是限制其规模化生产的重要因素。红法夫酵母胞内合成的虾青素占总类胡萝卜素的40％～95％，被认为是最具潜力实现工业化生产虾青素的微生物。
[0004]基于目前制约工业化发酵生产虾青素的因素诸，诸如虾青素产量低，生产成本居高不下，发酵工艺较复杂，许多国内公司和研究机构主要围绕菌株和工艺进行攻关。如专利号CN109971664A利用酿酒酵母构建整合了有香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因crtE，八氢番茄红素合成酶基因crtYB，八氢番茄红素脱氢酶基因crtI和β
‑
胡萝卜素羟化酶基因crtZ以及β
‑
胡萝卜素酮化酶基因crtW的菌株，经等离子体诱变、SCRaMbLE诱变，获得一株高产的诱变菌株AS30，摇瓶发酵的虾青素产量为46.4mg/L，较出发菌株提高11.5倍。
[0005]专利号CN110195023A在前期工作基础之上，采用浓度梯度递减的间歇补料方式向发酵罐培养基中补加酵母浸粉，在5L发酵罐中获得404.78mg/L的虾青素产量。
[0006]专利号CN111979132A通过优化发酵培养基成分，去除了常规发酵培养基中所添加的锌离子，并添加铁离子和优化其浓度，大幅提高了虾青素产量和虾青素纯度，在30L发酵罐的酿酒酵母虾青素产量最高达1530mg/L。
[0007]专利号CN104178430A用亚硝基胍进行诱变，通过摇瓶发酵筛选获虾青素产量高的
菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株VR
‑
032。该菌株利用蔗糖为发酵碳源，在5L发酵罐中虾青素产量达到68.7mg/L，相比原始出发菌株提高了20.8％。
[0008]专利号CN106801019B从落叶上筛选到的自然菌株红法夫酵母XQ(Phaffia rhodozyma XQ)，其虾青素产量为55.77mg/L；申请人进一步通过紫外诱变和2
‑
脱氧
‑
D
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葡萄糖筛选获得的突变菌株红法夫酵母XQS，其虾青素产量达78.42mg/L，比出发菌株红法夫酵母XQ提高了40.6％。
[0009]专利号CN108998493B在高产虾青素的发酵培养基中添加中药膏剂防风、黄芪、大黄、杏鲍菇、连翘，红法夫酵母繁殖对数期再添加6
‑
苄基腺嘌呤、吲哚乙酸、β
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萘氧乙酸，有效的提高了红法夫酵母的细胞活性，改善糖酵解途径及磷酸戊糖途径，加速酵母细胞生长与繁殖，在发酵罐中获得120.6mg/L的虾青素产量。
[0010]专利号CN106318878B通过代谢工程方法，提高红法夫酵母胞内乙酰辅酶A合成，降低甾醇类物质合成以及提高虾青素合成途径代谢通量的基因元件表达盒转化宿主，获得红法夫酵母工程菌株SXD，所获得的红法夫酵母工程菌株SXD的最高虾青素含量为4.4mg/g细胞干重，优化培养后的虾青素含量为7.1mg/g。
[0011]专利号CN106676019B利用已经构建好能够生物合成虾青素的模式生物解脂耶氏酵母，优化培养后在发酵罐获得450mg/L的虾青素产量。袁雪峰利用中国科学院微生物生理与代谢工程重点实验室构建、筛选的基因工程菌E.coli
‑
LY01，通过对发酵过程中pH、温度、诱导剂添加量和补糖方法的优化，建立了一套大肠杆菌高密度发酵工艺，在1L发酵罐中实现了958mg/L的虾青素产量，虾青素含量为17.2mg/g。
[0012]然而这些发酵液虾青素产量能做到400mg/L以上的，几乎是利用基因工程进行改造的模式菌株，这些菌株并非能够天然自身合成虾青素。因此，大规模的工业化生产暂时未见报道。
技术实现思路
[0013]本专利技术的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺。
[0014]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种红法夫酵母菌株，命名为红法夫酵母菌株(Xanthophyllomyces dendrorhous/Phaffia rhodozyma)，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413。
[0015]一种提升如上述的红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，包括以下步骤：
[0016]S1、摇瓶种子液制备：将事先从甘油管到固体平板活化好的菌株刮取到灭菌的摇瓶种子培养基中，并在转速150～200rpm，温度20～24℃条件下培养24～28h，获得摇瓶种子液；
[0017]S2、一级种子液制备：将步骤S1摇瓶种子液按3％～10％接种到一级种子罐中，并在转速150～200rpm，温度20～22℃，通气量0.6～1.8Nm3/h条件下培养22～26h，获得一级种子液；
[0018]S3、发酵培养：将步骤S2中一级种子液生长到特定菌数与菌体形态时，按3％～10％体积接种量转接入含有发酵培养基的发酵罐中，开启搅拌，转速200～300rpm，通气量2.4...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种红法夫酵母菌株，其特征在于：命名为红法夫酵母菌株(Xanthophyllomyces dendrorhous/Phaffia rhodozyma)，于2020年8月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2020413。2.一种提升如权利要求1所述的红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：S1、摇瓶种子液制备：将事先从甘油管到固体平板活化好的菌株刮取到灭菌的摇瓶种子培养基中，并在转速150～200rpm，温度20～24℃条件下培养24～28h，获得摇瓶种子液；S2、一级种子液制备：将步骤S1摇瓶种子液按3％～10％接种到一级种子罐中，并在转速150～200rpm，温度20～22℃，通气量0.6～1.8Nm3/h条件下培养22～26h，获得一级种子液；S3、发酵培养：将步骤S2中一级种子液生长到特定菌数与菌体形态时，按3％～10％体积接种量转接入含有发酵培养基的发酵罐中，开启搅拌，转速200～300rpm，通气量2.4
‑
2000Nm3/h，开始发酵；发酵至一段时间后往发酵罐中流加前体物，直到溶氧低于预设区间时停止流加，获得富含虾青素的红法夫酵母发酵液。3.根据权利要求2所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述摇瓶种子培养基包括以下质量浓度的组分：酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，pH6.0；所述一级种子培养基包括以下质量浓度的组分：葡萄糖20g/L，酵母浸粉12g/L，硫酸铵6g/L，蔗糖6g/L，MgSO4·
7H2O 2.2g/L，KH2PO
4 2g/L，CaCl
2 0.09g/L，聚醚消泡剂0.5g/L，pH6.0。4.根据权利要求2所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述步骤S3中前体物包括八氢番茄红素、番茄红素、β
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胡萝卜素、β
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隐黄质、海胆烯酮、3(或3')
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羟基海胆酮、玉米黄素、角黄素、金盏花黄质、芬尼黄质中的一种或两种；且所述前体物用油、水、乙醇中的一种或两种溶剂进行溶解，其浓度为10～300g/L。5.根据权利要求2所述的提升红法夫酵母菌株产虾青素的发酵工艺，其特征在于：所述步骤S3发酵前期以柠檬酸和氨水维持pH稳定在6.0左右；发酵至18～22h，溶氧降至低点时，逐步提高发酵罐搅拌转速与通气量，使发酵罐内溶氧维持在25％左右，每天检测四次发酵液葡萄糖浓度，以54％葡萄糖浓缩液补料维持罐内发酵液残余葡萄糖浓度在1～3g/L；60～64h后逐步降低发酵罐搅拌转速，使罐内溶氧维持在40～60％，在72～84h，待菌体干重达到稳定时，将发酵罐的pH均调节至5.0左右，直至发酵结束。6.根据权利要求5所述的提升红法...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱先峰，张兵，敬科举，张春发，
申请(专利权)人：厦门昶科生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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