一种用于同时检测金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的半抗原、人工抗原及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于同时检测金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。所述半抗原的结构式如式Ⅰ所示，是将金刚烷胺(AMD)、3

【技术实现步骤摘要】
一种用于同时检测金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的半抗原、人工抗原及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及抗原抗体检测
，更具体地，涉及一种同时含金刚烷胺 (AMD)、3
‑
甲基
‑
喹恶啉
‑2‑
羧酸(MQCA)及氯霉素胺(CAPA)骨架结构的 AMC型多簇串联线性半抗原、人工抗原及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]我国是世界上最大的畜产品生产和消费大国，据统计，2010年我国肉类总 产量己达7925.8万吨，居世界首位。目前已报道的畜产品兽药残留分析检测技 术主要集中大型精密仪器分析技术和免疫分析筛查技术，其中仪器确证法以液相 色谱
‑
串联质谱法(HPLC
‑
MS/MS)为主。例如中国专利公开了一种用于测定中 兽药散剂中11种非法添加药物含量的方法，可同时检测包含金刚烷胺、喹乙醇、 氯霉素等在内的11种非法添加药物进行检测，然而仪器法通常具有样品预处理 操作复杂、费时、成本高，不适合现场检测等缺点。免疫分析法具有灵敏度与常 规的仪器分析一致，适合现场筛选，简单、快速、成本低、样品所需量少、前处 理简单方便等优点。目前，畜产品安全检测中以单残留免疫检测方法为主，例如 中国专利CN108152499A、CN111077319A、CN108519480A等分别公开了针对 金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的免疫检测方法。然而，由于兽药种类的多样性及其 复配使用的广泛性和复杂性，仅发展单残留免疫检测技术已不能满足实际检测需 求，但是目前缺少用于同时检测非共有结构小分子药物金刚烷胺、喹乙醇、氯霉 素的相关半抗原、抗原和抗体。
[0003]
技术实现思路

[0004]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一 种可以实现非共有结构小分子药物金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的多残留免疫检测 的半抗原。通过将金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素这三个不同结构小分子药物视为不 同表位，将其通过适当方式串联成线性多簇半抗原，以此来提高多表位中和识别 能力。
[0005]本专利技术的第二个目的是提供所述半抗原的制备方法。
[0006]本专利技术的第三个目的是提供所述半抗原的应用。
[0007]本专利技术的第四个目的是提供一种人工抗原。
[0008]本专利技术的第五个目的在于提供所述人工抗原的制备方法。
[0009]本专利技术的第六个目的在于提供所述人工抗原的应用。
[0010]本专利技术的第七个目的在于提供一种抗原特异性抗体。
[0011]本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现：
[0012]一种用于同时检测金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的半抗原，同时含金刚烷胺 (AMD)、3
‑
甲基
‑
喹恶啉
‑2‑
羧酸(MQCA)及氯霉素胺(CAPA)骨架结构，其 结构通式如式Ⅰ所示：
[0013][0014]其中，R1和R2分别选自碳原子个数为2～5的烷基，即R1和R2分别选自乙 基至戊基中的任意一种。
[0015]优选地，所述R1选自丙基或戊基，R2选自乙基或丁基。
[0016]进一步优选地，所述半抗原结构式如下AMC
‑
4C或AMC
‑
6C所示：
[0017][0018][0019]所述性半抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0020]S1.分别制备喹乙醇代谢物、金刚烷胺、氯霉素中间体：以乙酰乙酸甲酯为 原料经过NBS溴代、4
‑
硝基邻苯二胺环化、还原硝基、上氨基保护基、酯键水 解，得到式Ⅱ所示喹乙醇代谢物中间体；以金刚烷为原料经过硝化、硝基还原、 氨基酰化、水解后在其中1个氨基上连接叔丁氧羰基保护的氨基酸手臂，然后， 在另1个氨基上连接芴甲氧羰酰基，最后脱除Boc保护基，得到式Ⅲ所示金刚烷 胺中间体；将氯霉素的二氯乙酰基水解除去，得到式Ⅳ所示氯霉素中间体氯霉素 胺；
[0021][0022]其中，R1和R2分别选自碳原子个数为2～5的烷基，即R1和R2分别选自乙 基至戊基中的任意一种；
[0023]S2.半抗原的合成：将式III所示金刚烷胺中间体与式II所示喹乙醇代谢物中 间
体，通过分子上的伯氨基与羧基缩合偶联，然后脱除喹乙醇代谢物中间体的芳 环氨基的DMB保护基后，通过酰化缩合反应偶联得到中间体
Ⅴ
，然后将中间体
ꢀⅤ
通过其羧基与式Ⅳ所示氯霉素中间体的氨基经酰化缩合得到中间体
Ⅵ
，再进一 步脱去Fmoc保护基后分别与4
‑
氧丁酸甲基酯缩合还原胺化为中间体
Ⅶ
，最后水 解酯基，得到式Ⅰ所示的半抗原。
[0024]优选地，所述R1选自丙基或戊基，R2选自乙基或丁基。
[0025]本专利技术还提供所述半抗原在制备人工抗原中的应用。
[0026]一种人工抗原，由上述式Ⅰ所示半抗原与载体蛋白偶联得到，其结构如式
Ⅷꢀ
所示：
[0027][0028]其中，R1和R2分别选自碳原子个数为2～5的烷基，即所述R1和R2分别选 自乙基至戊基中的任意一种。
[0029]优选地，所述R1选自丙基或戊基，R2选自乙基或丁基。
[0030]进一步优选地，所述R1和R2分别选自丙基和乙基组合，戊基与丁基组合， 其取代后的结构式如下AMC
‑
4C
‑
载体蛋白或AMC
‑
6C
‑
载体蛋白所示：
[0031][0032]优选地，所述载体蛋白为乳铁蛋白(LF)、钥孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋 白(OVA)。LF、KLH用于制备免疫原，OVA用于制备包被原。
[0033]所述人工抗原的制备方法，是在式Ⅰ所示半抗原的羧基上偶联载体蛋白得到。
[0034]优选地，所述偶联为通过活泼酯法。
[0035]作为一种优选地可实施方式，所述人工抗原的制备方法，包括如下步骤：将 式Ⅰ所示半抗原、1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N
‑
羟基 丁二酰亚胺(NHS)溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)中，4℃搅拌反应过夜，记 为A液。称取载体蛋白溶于磷酸缓冲溶液(PBS，0.01M，pH 7.4)中，搅拌溶 解制成B液。磁力搅拌下，吸取A液逐滴加入到B液中，4℃下磁力搅拌反应， 将反应液于4℃下用PBS透析3天，每天换2次透析液，即可得到人工抗原。
[0036]本专利技术还提供所述人工抗原在制备单/多克隆抗体、单链抗体或纳米抗体中 的应用。
[0037]一种多克隆抗体，是以式
Ⅷ
所示人工抗原免疫小鼠制备得到。
[0038]优选地，是以载体蛋白为乳铁蛋白(LF)或钥孔血蓝蛋白(KLH)的人工 抗原为免疫原，选取适龄雌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测金刚烷胺、喹乙醇、氯霉素的半抗原，其特征在于，其结构通式如式Ⅰ所示：其中，R1和R2分别选自碳原子个数为2～5的烷基。2.根据权利要求1所述半抗原，其特征在于，所述R1选自丙基或戊基，R2选自乙基或丁基。3.权利要求1所述半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.分别制备喹乙醇代谢物、金刚烷胺、氯霉素中间体：以乙酰乙酸甲酯为原料经过NBS溴代、4
‑
硝基邻苯二胺环化、还原硝基、上氨基保护基、酯键水解，得到式Ⅱ所示喹乙醇代谢物中间体；以金刚烷为原料经过硝化、硝基还原、氨基酰化、水解后在其中1个氨基上连接叔丁氧羰基保护的氨基酸手臂，然后，在另1个氨基上连接芴甲氧羰酰基，最后脱除Boc保护基，得到式Ⅲ所示金刚烷胺中间体；将氯霉素的二氯乙酰基水解除去，得到式Ⅳ所示氯霉素中间体氯霉素胺；其中，R1和R2分别选自碳原子个数为2～5的烷基；S2.半抗原的合成：将式III所示金刚烷胺中间体与式II所示喹乙醇代谢物中间体，通过分子上的伯氨基与羧基缩合偶联，然后脱除喹乙醇代谢物中间体的芳环氨基的DMB保护基后，通过酰化缩合反应偶联得到中间体

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金易，沈玉栋，贺颖，王弘，徐振林，雷红涛，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：