基于铁蛋白轻链亚基的缀合物及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域。具体而言，本发明专利技术涉及基于铁蛋白轻链亚基的缀合物及其应用。明涉及基于铁蛋白轻链亚基的缀合物及其应用。

【技术实现步骤摘要】
基于铁蛋白轻链亚基的缀合物及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。具体而言，本专利技术涉及基于铁蛋白轻链亚基的缀合物及其应用。
[0002]专利技术背景
[0003]在人体或其他哺乳动物体内分离的铁蛋白通常由两种不同的铁蛋白亚基(H亚基和 L亚基)构成，H亚基和L亚基的分子质量分别为21KDa和19Kda。典型的铁蛋白结构是由24个轻链/重链亚基自组装形成的球壳状结构，外径12nm，内部形成直径8nm 的内腔结构。
[0004]铁蛋白的单个亚基都是从N端起折叠成为4段长α螺旋和1段短α螺旋在C端结束。铁蛋白组装成完整蛋白壳后，每个铁蛋白亚基的N端暴露在蛋白壳外表面，而C端折叠到蛋白壳的内表面。相邻的三个铁蛋白亚基的N端形成了铁蛋白的三重对称轴，4个铁蛋白亚基的第4段α螺旋与第5段α螺旋之间的柔性氨基酸环状区形成了铁蛋白的四重对称轴。
[0005]铁蛋白轻链(ferritin light chain，FTL)是组成细胞内铁蛋白复合体的重要亚基之一，可加速铁从亚铁氧化酶中心向铁核内的转移，提高铁蛋白结合铁的能力，对长期铁储存非常重要。它大部分位于细胞质中，极少量位于细胞外如血清和脑脊液中，属于分泌型铁蛋白。长久以来，人们对于胞质铁蛋白的研究始终围绕其在铁代谢过程中的作用，而对于它的其他功能，却知之甚微。目前，用大肠杆菌表达系统已经能够表达获得重组重链铁蛋白(HFn)和重组轻链铁蛋白(LFn)。在这两类铁蛋白中，由于HFn具有与Tfr1 受体结合的能力，并具有穿越血脑屏障的能力，赋予其肿瘤靶向性，因此其具备成为药物载体的巨大潜力，成为目前的研究热点，而LFn由于不具备靶向性，则对于其生物应用功能的研究开发还远未受到关注，目前采用LFn作为药物载体的相关报道甚少。
[0006]在铁蛋白诸多应用场景中，内包药物的种类因受铁蛋白本身蛋白选择性的影响，因此能够包入内腔的药物种类受到限制。而通过融合蛋白的构建方式虽然可以扩展铁蛋白载带蛋白药的种类，但由于需要应用分子生物学的方法进行重组表达，步骤复杂、效率低、周期长、成本高。而且每设计一个铁蛋白负载药物，均需要经历基因序列设计、蛋白表达纯化、杂质控制的全流程，这难以满足高通量筛选铁蛋白荷载药物的需要，不利于铁蛋白药物的成药开发。因此，以化学方式将药物偶联于LFn表面将赋予铁蛋白药物载体系统方便性，以及更多的可能性。目前，还未有通过对LFn外表面进行突变以获得化学偶联载药系统，从而达到递送药物目的的相关报道。
[0007]附图简述
[0008]图1：重组表达质粒双酶切电泳图。
[0009]图2
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4：13个突变体的SDS
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PAGE结果。
[0010]图5：mLFn透射电镜形态图。
[0011]图6：mLFn
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11的DLS图谱。
[0012]图7：mLFn
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3单体和SN38单体的缀合反应性。

技术实现思路

[0013]一、定义
[0014]在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。
[0015]如本文所用，术语“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B 和C”。
[0016]“铁蛋白”是指由蛋白外壳和铁内核两部分构成的储铁结构。天然情况下，铁蛋白的蛋白外壳是通常由24个亚基自组装形成的笼状蛋白结构(外径12nm，内径8nm)，而铁内核的主要成分为水铁矿。不含铁内核的铁蛋白的蛋白外壳也称为“去铁蛋白”。本文所述“铁蛋白”包括真核生物铁蛋白和原核生物铁蛋白，优选真核生物铁蛋白，更优选哺乳动物铁蛋白，例如人铁蛋白。真核生物铁蛋白通常包括重链H亚基和轻链L亚基。在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。然而，通过重组方式，也可以获得仅由H亚基组装成的“H铁蛋白(HFn)”或仅由L亚基组装成的“L铁蛋白(LFn)”，或者包含不同的H亚基/L亚基比例的重组铁蛋白。
[0017]“笼状蛋白”，也称作“纳米笼”，是指由多个能够自组装的多肽(亚基)形成的具有内部中央空腔的三维蛋白结构，即笼状结构。组装成笼状蛋白的多肽(亚基)数目没有特别限制，只要其能够形成所述笼状结构。笼状蛋白可以具有对称结构，也可以具有非对称结构，取决于其亚基组成。典型的笼状蛋白包含铁蛋白或去铁蛋白。
[0018]“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本专利技术中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸的聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP
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核糖基化。
[0019]如本文所用，“多核苷酸”是指多个核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的大分子，其中所述核苷酸包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本专利技术的多核苷酸的序列可以针对不同的宿主细胞(如大肠杆菌)进行密码子优化，从而改善多肽的表达。进行密码子优化的方法是本领域已知的。
[0020]“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本专利技术所述的活性。此外，本领域技术人员清楚多肽N端由起始密码子编码的甲硫氨酸在某些实际情况下(例如在特定表达系统表达时)会被保留，但不实质影响多肽的功能。因此，本申请说明书和权利要求书中在描述具体的多肽氨基酸序列时，尽管其可能不包含N端由起始密码子编码的甲硫氨酸，然而此时也涵盖包含该甲硫氨酸的序列。相应地，其编码核苷酸序列也可以包含起始密码子。
[0021]两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的“序列相同性”指的是所述序列之间的相同的氨基酸或核苷酸的百分比。评估多肽或多核苷酸序列之间的序列相同性水平的方法
是本领域已知的。序列相同性可以使用已知的各种序列分析软件评估。例如，序列相同性可以通过EMBL
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EBI的在线比对工具来评估(https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/)。两个序列之间的序列相同性可以使用Needleman
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Wunsch算法，使用默认参数来评估。
[0022]如本专利技术所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在生物体中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铁蛋白轻链(L)亚基突变体多肽，其相对于野生型铁蛋白L亚基，在loop区中包含一个半胱氨酸残基。2.权利要求1的突变体多肽，相对于野生型铁蛋白L亚基，所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87和88位之一的位置处的氨基酸被半胱氨酸取代。3.权利要求1或2的突变体多肽，相对于野生型铁蛋白L亚基，1)所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第127位的位置处包含半胱氨酸，或2)所述突变体多肽在对应于SEQ ID NO:1的第127位的位置处不包含半胱氨酸，或3)所述突变体多肽仅在loop区中包含一个半胱氨酸残基。4.权利要求1或2的突变体多肽，其中所述突变体多肽1)在对应于SEQ ID NO:1的第76位的位置处的氨基酸残基例如精氨酸残基R被半胱氨酸残基取代；2)在对应于SEQ ID NO:1的第77位的位置处的氨基酸残基例如丙氨酸残基A被半胱氨酸残基取代；3)在对应于SEQ ID NO:1的第78位的位置处的氨基酸残基例如亮氨酸残基L被半胱氨酸残基取代；4)在对应于SEQ ID NO:1的第79位的位置处的氨基酸残基例如苯丙氨酸残基F被半胱氨酸残基取代；5)在对应于SEQ ID NO:1的第80位的位置处的氨基酸残基例如谷氨酰胺残基Q被半胱氨酸残基取代；6)在对应于SEQ ID NO:1的第81位的位置处的氨基酸残基例如天冬氨酸残基D被半胱氨酸残基取代；7)在对应于SEQ ID NO:1的第82位的位置处的氨基酸残基例如异亮氨酸残基I被半胱氨酸残基取代；8)在对应于SEQ ID NO:1的第83位的位置处的氨基酸残基例如赖氨酸残基K被半胱氨酸残基取代；9)在对应于SEQ ID NO:1的第84位的位置处的氨基酸残基例如赖氨酸残基K被半胱氨酸残基取代；10)在对应于SEQ ID NO:1的第85位的位置处的氨基酸残基例如脯氨酸残基P被半胱氨酸残基取代；11)在对应于SEQ ID NO:1的第86位的位置处的氨基酸残基例如丙氨酸残基A被半胱氨酸残基取代；12)在对应于SEQ ID NO:1的第87位的位置处的氨基酸残基例如谷氨酸残基E被半胱氨酸残基取代；或13)在对应于SEQ ID NO:1的第88位的位置处的氨基酸残基例如天冬氨酸残基D被半胱氨酸残基取代。5.权利要求1的突变体多肽，其中所述突变体多肽包含选自SEQ ID NO:2
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14之一的氨基酸序列。6.权利要求1
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5中任一项的突变体多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁会，劳芳，姚德惠，丁凤姣，张泽译，王晓飞，希伦，成键伟，闫西冲，张荣坤，荣鹏飞，柯天一，
申请(专利权)人：昆山新蕴达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：