不含RNA的动物血清制造技术

本发明专利技术涉及不含RNA的哺乳动物血清,其可被用于细胞培养或生产药用生物产品，因为这一事实保持了它们的补充特性。本发明专利技术的另一个实施方式涉及从哺乳动物血清中去除RNA的方法，所述方法通过应用连续的血清加热、碱化和中和步骤。步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】不含RNA的动物血清


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，特别是细胞培养补充剂领域。一般而言，本专利技术涉及一种血清，优选是胎牛血清，其核糖核酸(RNA)被减少或具有低于检测极限的最小RNA含量，本专利技术还涉及一种用于从血清中去除RNA的方法。这种RNA减少的血清可用于分析细胞培养物的RNA表达，而不会干扰动物血清中通常存在的RNA的分析。

技术介绍

[0002]细胞培养是基础和生物医学体外研究的主要工具之一，包括将来自非常不同类型的动物(从昆虫到哺乳动物)的细胞，保存在温度、湿度和二氧化碳百分比的受控条件下。为了使细胞保持活力并持续分裂，细胞培养物保存在含有适量盐的液体培养基中，以使细胞发挥其最基本的代谢功能(Swain P.Basic Techniques and Limitations in Establishing Cell Culture:a Mini Review.Adv Anim Vet Sci(2014)doi:10.14737/journal.aavs/2014/2.4s.1.10and Arora M.Cell Culture Media:A Review.Mater Methods(2013)doi:10.13070/mm.en.3.175)。
[0003]体外细胞培养的一个重要成分是血清，因为它含有高含量的生长因子、脂质、蛋白质和其他使细胞保持不断分裂的必要因子。通过这种方式，将血清作为营养补充剂添加到维持细胞培养的合成液体培养基中。用于此目的的血清，来源可以是来自人、马或牛，世界范围上最广泛使用的则是胎牛血清(SFB)(Arora M.Cell Culture Media:A Review.Mater Methods(2013)doi:10.13070/mm.in.3.175.)。
[0004]除了上述成分外，SFB还含有高含量的核酸，其中最丰富的是具有多种生物学功能形式的RNA，例如转运RNA(tRNA)、核醣体RNA(rRNA)、小分子RNA(miRNA)、Piwi关联RNA(pi
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RNA)、核仁RNA(snoRNA)等(Chen X,et al.Cell Res.2008Oct；18(10):997
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1006)。一些不同类型的RNA包含在细胞外囊泡(VE)中，而其他类型的RNA包含在细胞外囊泡中(Keerthikumar S.et al.J Mol Biol.2016Feb 22；428(4):688
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692)。
[0005]VE是直径为50
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400nm的微结构，由脂质双层组成，包含蛋白质、各种类型的生物功能RNA和一些小分子。VE由其亚群所组成，这些亚群的直径和组成它们的分子含量彼此不同，其中外泌体50
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120nm直径的VE是研究最广泛的(Colombo M.et al.Annu Rev Cell Dev Biol.2014；30:255
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89)。VE一个重要方面是，它们已被证明能够在体外和体内将其内容物转移到受体细胞；因此，它们被认为是一种细胞间通讯系统，可能在新陈代谢以及癌症和糖尿病等疾病的发展中具有重要意义(Muralidharan
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Chari V.et al.J Cell Sci.2010May 15；123(Pt 10):1603
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11and Bobrie A.et al.Traffic.2011Dec；12(12):1659
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68)。
[0006]培养细胞的研究证明，SFB的VE能够将其RNA内容物转移到人和鼠的细胞系中；强调在使用SFB时，牛RNA在细胞培养物中的可能转移。这一发现揭示，自从迄今为止发现miRNA以来，关于检测和分析miRNA表达的科学文献很可能是牛RNA与手头上研究中来自物种细胞系的混合物。迄今为止，对于牛RNA的检测及其在细胞培养物中的可能功能，干扰程度的大小尚不清楚。主要原因是超过70％的奶牛miRNA与其他哺乳动物的miRNA相同，包括
人类的(Wei Z.et al.Sci Rep.2016Aug 9；6:31175)。
[0007]从这个意义上说，Wei等人描述了SFB含有各种类型的RNA，包括蛋白质编码RNA和调节RNA，包括信使RNA、小分子RNA(miRNA)、核醣体RNA和小核RNA，即使在应用超速离心后，仍高达70％的RNA可保留在血清中过程。
[0008]Wei等人指出SFB特有的RNA与来自细胞培养物的RNA一起被分离出来，这可能会在随后的RNA分析中造成干扰或误解，这就是为什么需要使用不含RNA的血清来进行此类研究的原因(Tosar JP.J Extracell Vesicles.2017Jan 12；6(1):1272832)。
[0009]为了减少可能的干扰或误解，由于用于细胞培养的血清中存在内源性VE，已经开发了几种方法来消除血清中的VE。
[0010]从这个意义上说，美国专利9,005,888描述了由动物细胞产生的VE的分离方法和产生VE含量降低的血浆或血清的方法，表明在应用该方法后，一些最初存在的miRNA无法通过定量PCR(qPCR)检测到。然而，美国专利9,005,888中描述的方法有几个缺点，包括使用含有聚乙二醇(PEG)的沉淀溶液，其残留物保留在处理过的血清中，进而可被视为污染物元素。
[0011]例如，已经描述了的PEG可以诱导异核生物的形成，即细胞融合以获得多核细胞(Davidson RL,Gerald PS.Somatic Cell Genet.1976Mar；2(2):165
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76.)，因此留在SFB中的PEG可以改变细胞的生物学功能，从而在分子生物学实验中产生改变的结果。
[0012]除此之外，不能排除血清中剩余的PEG会影响通过常规方法(例如Trizol)提取RNA，并且美国专利9,005,888中描述很少或检测不到RNA是由于由PEG引起的伪影所影响，而不是RNA本身被去除。
[0013]值得注意的是，正如Wei等人所述，大部分血清RNA不包含在VE内，而是包含在其外部。这极大地限制了使用PEG处理的血清时，细胞培养物中没有RNA污染的确定性。同样地，尽管使用PEG沉淀方法也可以从血清中沉淀出高浓度的蛋白质，但尚不清楚是否可以完全去除循环RNA相关蛋白复合物，这对于VE含量来说是外源性的(Tosar et al.)。
[0014]同样重要的是要指出，美国专利9,005,888中描述的方法所需要的步骤和血清操作危害到其无菌条件，这可能会迫使需要包含一个额外的步骤以便在血清经PEG处理后，使其恢复到无菌状态；这是为了在无菌细胞培养中使用SFB，这将增加在没有VE的情况下生产血清所产生的时间和费用。另一个重要的方面是，PEG方法不能完全去除血清中存在的VE，因为所描述的实施方式之一定义了减少VE的血清，其浓度不超过每毫升104个囊泡。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种动物血清，其特征在于所述血清不含RNA或实质上不含RNA。2.根据权利要求1所述的血清，其中，所述血清是来自牛、马、人、小鼠、大鼠或山羊，或相应的胎儿血清的变体之一。3.根据权利要求1至2中任一项所述的血清，其中，所述血清是胎牛血清。4.一种用于从哺乳动物血清中去除RNA的方法，所述方法包括：(a)将所述血清加热到52℃至63℃之间的温度；(b)将所述血清冷却到8℃至25℃之间的温度；(c)将所述血清碱化到10至12之间的pH值；(d)将所述血清中和至生理pH值，其中，这些步骤按此顺序进行。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述血清是来自牛、马、人、小鼠、大鼠或山羊，或相应的胎儿血清的变体之一。6.根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中，将所述血清加热到55℃至57℃之间的温度。7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，将所述温度维持30分钟至45分钟。8.根据权利要求4至7中任一项所述的方法，其中，进行所述血清的碱化直至达到pH 12。9.根据权利要求4至8中任一项所述的方法，其中，所述血清的碱化使用选自以下具有碱性化学性质的化合物进行：氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、氢氧化镁(Mg(OH)2)、氢氧化钙(Ca(OH)2)等。10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其中，所述碱化维持3分钟至20分钟的时间。11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中，所述碱化维持5分钟至10分钟的时间。12.根据权利要求4至11中任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡洛斯，
申请(专利权)人：国家基因组医学研究所，
类型：发明
国别省市：