一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖

【技术实现步骤摘要】
一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法


[0001]本专利技术涉及一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，属于疫苗的下游生产领域。

技术介绍

[0002]肺炎球菌是肺炎、脑膜炎、中耳炎和鼻窦炎的主要病原菌，也是引起婴幼儿和老年人发病和死亡的重要病因。细菌荚膜多糖疫苗在预防由肺炎球菌、脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌等引起的侵袭性疾病均有良好的效果，但肺炎球菌荚膜多糖是属于非T细胞依赖性抗原，婴幼儿的免疫系统发育不完全，多糖抗原不能对两岁以下幼儿产生有效免疫应答，而多糖
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蛋白结合疫苗可将非T细胞依赖性抗原转变为T细胞依赖性抗原，并在婴幼儿体内产生免疫原性和保护力。
[0003]多糖
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蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，多糖
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蛋白结合疫苗制备工艺中常见的多糖活化剂有溴化氰和1
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氰基
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二甲氨基吡啶四氟化硼(CDAP)。溴化氰可以在水环境下几分钟内完成活化过程，操作简便，但是它毒性较大。相对溴化氰，CDAP活化条件相对温和，活化效率更高，而毒性却低很多，因此近年来，CDAP被广泛应用于多糖
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蛋白结合疫苗工艺制备中。
[0004]文献报道CDAP活化多糖有两种机理，第一种活化机理中，CDAP上氰基活化多糖上的羟基，产生多糖衍生物和DMAP，而第二种活化机理中CDAP上的氰基活化多糖上的羟基后产生多糖衍生物，此时并无DMAP产生，而DMAP是在蛋白加入之后产生。
[0005]第一种活化机理：
[0006][0007]第二种活化机理：
[0008][0009]无论哪种活化机理，CDAP最终都转化为DMAP，而相对于溴化氰，DMAP是一种低毒性化合物，但仍具有毒性、刺激性，可损伤眼睛、皮肤、呼吸系统和神经系统等，危害人体健康，因此控制和监测多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量，对于保障其质量和使用安全性具有非常重要的意义。
[0010]目前DMAP检测的相关研究较少，已有报道采用GC
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MS和HPLC法测定，其中GC
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MS法测定灵敏度高，但方法较为繁琐，而且检测成本较高；HPLC法检测具有操作简便，专属性强，检测成本低等优点，但是DMAP是一种强极性碱性化合物，在常规反相色谱上无保留，无法实
现与溶剂峰的分离。本申请采用离子对反相色谱法，不仅实现了DMAP在色谱柱上的保留，同时也实现了CDAP在色谱柱上的保留，并且可有效的将二者分离。此方法可对多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量有效监测，也可验证CDAP活化多糖的反应机理，为结合疫苗的质量控制提供了依据。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是获得一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法。
[0012]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法的技术方案如下：
[0013]所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。
[0014]由于DMAP是一种强极性的碱性化合物，在反相色谱分离模式下无保留，且峰形不佳。为增加保留、改善峰形，考察了氨水溶液
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乙腈体系、醋酸铵溶液
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乙腈体系、庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾(离子对缓冲液)溶液
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乙腈体系对DMAP保留行为和峰形的影响。结果表明，氨水溶液
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乙腈体系、醋酸铵溶液
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乙腈体系下DMAP有保留，但是色谱峰拖尾，柱效低，而庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾溶液
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乙腈体系下，如图1所示，DMAP不仅有保留，而且峰形对称、柱效高，故选择庚烷磺酸钠/磷酸二氢钾溶液
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乙腈体系为流动相，继而又考察了庚烷磺酸钠浓度、磷酸氢二钾浓度，离子对试剂缓冲液pH值，离子对试剂缓冲液与乙腈的比例对保留行为及峰形的影响。综合考虑DMAP的保留时间、峰形和色谱柱的长期稳定性，优选5mmol/L庚烷磺酸钠溶液(含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0):乙腈＝13:87(V/V)作为流动相。考虑DMAP极性强的特点，选择嵌入了极性基团的C18色谱柱，在选定的5mmol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相的条件下，考察了Ultimate Polar
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RP和Sepax HP
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C18两款极性C18色谱柱。前者柱效低，寿命短，故优选选择Sepax HP
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C18色谱柱。
[0015]优选地，所述检测方法以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999。进一步的，所述标准品的制备为：准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml，浓度为1mg/ml。
[0016]作为一种优选的实施方式，标准品储备溶液，分别用流动相稀释至浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml以绘制标准曲线。
[0017]优选地，DMAP作为CDAP的活化产物，CDAP活化多糖中间产物的制备步骤如下：
[0018]a)加入蛋白前中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤；
[0019]b)加入蛋白后中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，持续搅拌2min，加入CRM197蛋白溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。
[0020]优选地，供试品溶液的制备方法为：取1ml肺炎球菌多糖
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蛋白结合液，加100μl10％脱氧胆酸钠溶液(现配现用)，涡旋混匀，于冰水浴中放置30min。取出后立即加入50μl盐酸溶液(86
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1000)，涡旋混匀，10000rpm离心15min，取上清液用0.45μm水系滤器过滤。
[0021]与现有技术相比，本专利技术采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗
中DMAP残留量的方法采用反相离子对色谱法，通过优化的色谱条件，实现了DMAP在色谱柱上的保留，并且排除了溶剂和杂质的干扰。该方法准确度高，重复性好，将该方法用于肺炎球菌
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的测定，结果良好。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液的体积比为13:87。3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述5mmol/L庚烷磺酸钠溶液含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0。4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999。5.根据权利要求4所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，绘制所述标准曲线的标准品浓度为1mg/ml。6.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖
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蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述标准品的制备为：准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml。7.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖

【专利技术属性】
技术研发人员：向海，
申请(专利权)人：湘潭智联技术转移促进有限责任公司，
类型：发明
国别省市：