一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因的应用制造技术

本发明专利技术涉及植物分子基因工程技术领域，具体涉及一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因的应用，通过克隆出草莓MYB转录因子FaMYB5基因以及含有上述FaMYB5基因的表达载体、宿主菌，这种FaMYB5基因能够应用于调控草莓果实中柠檬酸积累、表达CS1和GAD基因，在草莓中过量表达FaMYB5促进草莓果实柠檬酸代谢，同时柠檬酸合成主要基因CS1表达量上升和降解基因GAD表达量明显下降。量明显下降。量明显下降。

【技术实现步骤摘要】
一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因的应用


[0001]本专利技术涉及植物分子基因工程
，具体涉及一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因的用。

技术介绍

[0002]有机酸是果实主要的品质组成因子，直接影响草莓果实的酸度和风味。适量的酸可以使水果更可口，果实酸度的调控具有很强的经济相关性，因为它与消费者的感知有关，因此是水果产业的重要制约因素。
[0003]大多数水果中主要有机酸为柠檬酸或苹果酸，柠檬酸是草莓果实中主要有机酸类型，占总有机酸的80％以上，其含量由合成、分解代谢、运输和液泡储存之间的平衡决定。不同品种之间的柠檬酸含量存在差异，并受遗传、成熟度和栽培管理措施等因素的影响。
[0004]果实有机酸代谢是一个复杂的生物学过程，在果实发育过程中，有机酸积累主要发生在果实膨大期，而随着果实成熟进程其含量逐渐下降。此外，柠檬酸不仅响应果实风味，也参与了果实的光合作用、呼吸作用以及氨基酸、芳香物质、酯类及酚类物质的合成、衰老等众多生物学过程。因此，草莓果实柠檬酸代谢研究是果实品质生物学的重要研究内容。
[0005]鉴于上述缺陷，本专利技术创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于解决如何提高果实中的柠檬酸含量的问题，提供了一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因的应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术公开了一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因在表达FaCS1和FaGAD基因中的应用，所述草莓MYB转录因子FaMYB5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术还公开了一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因调控草莓果实中柠檬酸代谢中的应用，所述草莓MYB转录因子FaMYB5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因调控草莓果实中柠檬酸代谢中的应用，采用注射法侵染果实。
[0010]与现有技术比较本专利技术的有益效果在于：本专利技术克隆出草莓MYB转录因子FaMYB5基因，并通过过表达转基因草莓试验发现，FaMYB5与果实柠檬酸代谢相关，将该基因过量表达后，其表达量增高，FaCS1和FaGAD主要基因表达量明显增加。可见，该FaMYB5基因在果实柠檬酸代谢中将具有广泛的应用。
附图说明
[0011]图1为草莓果实中克隆得到FaMYB5；
[0012]图2为实时定量PCR检测草莓果实注射后转录因子MYB5、合成关键基因CS2和降解基因GAD表达图；
[0013]图3为过表达注射草莓果实后柠檬酸含量的变化图。
具体实施方式
[0014]以下结合附图，对本专利技术上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
[0015]实施例1
[0016]以NCBI中搜索到的草莓MYB5基因序列为模板，进一步设计引物；以红颜草莓大绿期果实的cDNA为模版，以MYB5
‑
F为上游引物，以MYB5
‑
R为下游引物，进行PCR反应，克隆得到MYB5基因，转化pMD19
‑
T载体，提取质粒备用。本实施例使用的红颜草莓为安徽农业大学种质资源圃采集。
[0017]一、转化步骤如下：
[0018](1)连接产物转化大肠杆菌感受态：重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42℃的热击处理90s，促进吸收DNA，然后在37℃非选择LB液体(未添加抗生素)培养基中震荡培养45min，均匀地涂布在添加氨苄青霉素(Amp)抗生素的固体培养基中37℃过夜培养；
[0019](2)挑取单克隆，重新进行活化，即在新的含Amp抗生素的固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃过夜培养；
[0020](3)挑取菌落，按照上述PCR反应体系进行菌落PCR反应检测；
[0021](4)根据菌落PCR结果，挑取菌落，置于添加Amp的液体LB培养基中震荡培养12h，送去上海生工生物工程有限公司测序；
[0022](5)选取测序正确的单菌落，放入(20mL LB+20uL Amp)的LB液体培养基，37℃摇床摇12～16h，提质粒。
[0023]二、提质粒步骤如下：
[0024](1)取1～4mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000
×
g离心1min，弃尽上清；
[0025](2)加250μL Buffer SH1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块(确认Buffer S1中已加入RNaseA)；
[0026](3)加入250μL Buffer SH2，温和并充分地上下翻转4～6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；
[0027](4)加入350μL Buffer SH3，温和并充分地上下翻转4～6次，12000g离心10min；
[0028]吸取步骤(4)中的离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000g离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000g离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液，重复一次；将制备管移入新的1.5mL中，在制备管膜中央加50～80μL Eluent或去离子水，室温静置3～5min，12000g离心1min。
[0029]MYB5
‑
F：ATGAGGAACCCATCTTCGTCTTCAT，
[0030]MYB5
‑
R：CTATTGCGTCTGATTGACATTAACC。
[0031]PCR反应程序为：94℃变性1min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，35个循环；72℃10min，4℃保温。
[0032]如图1所示，草莓果实中克隆得到FaMYB5基因序列全长1041bp，编码347个氨基酸。其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0033]实施例2
[0034]将实施例1得到的FaMYB5基因，转化pMD19
‑
T载体，提取质粒；以FaMYB5
‑
pCXSN
‑
F和
FaMYB5
‑
pCXSN
‑
R为扩增引物，以pMD19
‑
T
‑
FaMYB5质粒为模板进行PCR反应，回收目的基因产物。将目的基因与pCXSN
‑
FLAG载体进行连接。16℃连接12h后热激法转化大肠杆菌感受态。提取验证正确的菌株质粒，冻融法转化农杆菌GV3101。菌落PCR鉴定。
[0035]具体如下：
[0036]采用pCXSN
‑
FLAG过量表达载体进行重组构建，在FaMYB5的5
’
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因在表达FaCS1和FaGAD基因中的应用，其特征在于，所述草莓MYB转录因子FaMYB5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种草莓MYB转录因子FaMYB5基因调控草莓果实中柠檬酸代谢...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵静，方从兵，谢兴斌，孙培培，刘雅鑫，潘志飞，江蓉谊，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：