一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂制造技术

本发明专利技术提供一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439

【技术实现步骤摘要】
一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂


[0001]本专利技术涉及遗传病基因检测领域，具体涉及一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因及其检测试剂。

技术介绍

[0002]Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种常见的遗传性肾炎综合征，主要表现为血尿、肾功能进行性减退、感音神经性耳聋和眼部异常。该病是由于编码肾小球基底膜的主要胶原成分
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IV胶原基因突变而产生的肾小球基底膜疾病。IV型胶原6条
ɑ
链聚合成3条三股螺旋分子结构称为单体，单体聚合形成二聚体或四聚体，再相互绞连形成胶原网状结构。电镜下可观察到Alport综合征特征性的病理改变，肾小球基底膜(Glomerular Basement Membrane，GBM)广泛增厚、或变薄以及致密层分裂为其典型病变。GBM致密层不规则的外观是超微结构最突出的异常，其范围既可累及所有的毛细血管襻或毛细血管襻内所有的区域，也可累及部分毛细血管襻或毛细血管襻内的部分区域。因此，临床常用肾活检术从病理上加以诊断，但这是一种有创检查，患者可能因此而出现并发症。不能为上述患者提供准确的治疗指导。
[0003]近年来，AS的致病基因已经被鉴定出来，使得肾病综合征的基因诊断成为可能。这些致病基因包括COL4A5、COL4A6、COL4A3和COL4A4，其筛查可以帮助临床医师完成AS的“基因诊断”。这不仅可避免临床盲目用药及由此带来的药物不良反应和经济负担，对某些患者还可能进行早期干预或治疗，延迟甚至避免终末期肾脏病(End stage renal disease，ESRD)的发生。
[0004]既往的研究显示：基因突变多位于全外显子区域，表现为某种氨基酸编码的突变。目前，对AS患者的致病基因的检测，多采用全外显子测序技术。如中国专利申请CN104450726A公开的COL4A5基因突变体及其应用。
[0005]然而，最近报道在基因内含子区域同样也可以存在某些突变而导致mRNA剪接改变。这些突变需要在mRNA水平对编码基因产生的效应进行证明。因此，鉴定内含子区域的致病突变，并研发省时、精准的对实验条件要求较低的诊断试剂对AS患者进行快速检测，对AS临床基因诊断具有必要性。
[0006]目前，对于AS患者基因内含子区域突变导致mRNA剪接改变而致病的报道相对较少。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种可导致mRNA剪接异常的AS致病基因突变，并基于此研发了突变检测试剂。该突变检测试剂可以快速、准确判断检测对象是否具有此致病突变。
[0008]本专利技术提供一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439
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7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439
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7(IVS7)A>G；
此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪接异常，导致改变编码蛋白质结构的移码突变。
[0009]进一步，所述mRNA剪接异常是指mRNA RT
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PCR产物第439
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7位多余6个碱基TAATAG。
[0010]本专利技术还提供上述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA
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PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA
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PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA
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PCR产物Sanger测序；当检测得到COL4A5基因第七号内含子区域，第439
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7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即COL4A5,c.439
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7(IVS7)A>G，确诊为Alport综合征患者。
[0011]其中，P1:AGCATTCTGTAATTGGCGTGTT(SEQ ID NO.1)；
[0012]P2:ATTGAAGTTGCCAGCTTTCCT(SEQ ID NO.2)。
[0013]进一步，所述用于患者基因组DNA提取的样本为：外周血、尿液或指甲。
[0014]本专利技术还提供上述COL4A5致病突变基因的另一病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括mRNA突变分析试剂，所述试剂包括1)患者样本RNA提取试剂盒；2))RT
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PCR扩增试剂盒：以引物P3和P4扩增患者RNA，获得目的条带；3)RT
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PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P3对RT
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PCR产物Sanger测序；当检测得到mRNA RT
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PCR产物第439
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7位多余6个碱基TAATAG时，确诊为Alport综合征患者。
[0015]其中，P3:ATGCAATGGAACCAAGGGAG(SEQ ID NO.3)；
[0016]P4:CATCAAACCTGGTGGTCCTG(SEQ ID NO.4)。
[0017]进一步，所述用于患者RNA提取的样本为：尿液或血液。
[0018]本专利技术还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1
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2所示。
[0019]上述病因学诊断试剂中用于基因组DNA
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PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0020]本专利技术还提供上述病因学诊断试剂中用于扩增患者RNA的引物对组P3和P4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3
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4所示。
[0021]上述病因学诊断试剂中用于RT
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PCR产物Sanger测序的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0022]本专利技术还提供上述病因学诊断试剂的制备方法，包括如下步骤：将所述引物对组中的4条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
[0023]该突变不存在于ClinVar数据库、dbSNP等数据库，为新发现的致病突变，可引起X
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连锁显性遗传的AS临床表现。
[0024]与现有技术相比，本专利技术的优势在于：
[0025]1.本专利技术公开的COL4A5致病突变基因是临床AS患者的致病突变之一，该突变导致mRNA剪接异常，进而导致蛋白翻译提前终止，编码蛋白功能异常。
[0026]2.本专利技术的检测试剂可有效、快速地检测COL4A5的上述致病突变。
[0027]3.本专利技术的检测试剂价格低廉，可减轻患者经济负担。
附图说明
[0028]图1：剪接突变示意图本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，其特征在于，所述突变位于COL4A5基因第七号内含子区域，第439
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7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439
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7(IVS7)A>G；此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪接异常，导致改变编码蛋白质结构的移码突变。2.根据权利要求1所述的Alport综合征患者COL4A5致病突变基因，其特征在于，所述mRNA剪接异常是指mRNA RT
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PCR产物第439
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7位多余6个碱基TAATAG。3.根据权利要求1所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂包括基因组DNA点突变分析试剂，所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂盒；2)DNA
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PCR扩增试剂盒：采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA，获得目的条带；3)DNA
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PCR产物Sanger测序试剂盒：以引物P2对DNA
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PCR产物Sanger测序；当检测得到COL4A5基因第七号内含子区域，第439
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7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤，即c.439
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7(IVS7)A>G，确诊为Alport综合征患者。4.根据权利要求3所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂，其特征在于，所述用于患者基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵景宏，黄英辉，张均，熊加川，章波，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：