TCF1-IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术公开了TCF1

【技术实现步骤摘要】
TCF1
‑
IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用


[0001]本专利技术涉及医学领域，具体涉及TCF1
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IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用。

技术介绍

[0002]慢性淋巴细胞白血病（CLL）是一种成熟B细胞恶性克隆性增殖性肿瘤，临床具有高度的异质性，多数进展缓慢，中位生存时间5
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10年。TP53异常、11q
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、IGHV未突变等生物学特性是目前用于预测疾病稳定和预后的常用指标，但检测费用高且费时。CLL患者的免疫微环境紊乱和T细胞免疫无能，且随疾病进展而逐渐加剧。T细胞作为构成其复杂肿瘤微环境的重要支柱细胞，通过细胞因子网络刺激活化或CD40链直接作用等促进CLL细胞的生存和增殖。反之，由于CLL的长期慢性刺激造成CD8+T细胞假性耗竭和终末分化T细胞比例增高，效应功能逐渐丧失。临床表现为CLL患者易感染、自身免疫性疾病和继发恶性肿瘤发生率高。这种免疫异常也是导致疾病进展、细胞免疫治疗失败的主要原因。因此，评估CLL患者的免疫功能状态是预测疾病进展快慢和预后的一种重要手段。
[0003]T细胞因子1（TCF1）在T细胞发育及亚群分化中发挥调控作用，对维持CD8+T细胞的干性及细胞毒活性至关重要，可介导有效的抗肿瘤免疫反应。与TCF1
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T细胞相比，TCF1+CD8+T细胞具有更加多样性的TCR组库，在肿瘤抗原识别和特异性免疫应答方面具有更大的潜力。也有研究认为TCF1表达缺失是对免疫检测点抑制剂治疗反应不佳的标志。我们前期通过TCGA数据库分析发现TCF1低表达CLL患者的疾病进展快和生存期短，而TCF1高表达患者的疾病稳定和生存时间显著延长。未来维持甚至诱导TCF1+CD8+T细胞可能是增强肿瘤控制和决定抗肿瘤免疫治疗成功的关键因素。
[0004]干扰素可调节因子4（IRF4）作为T细胞受体（TCR）反应相关转录因子，在原始及细胞毒效应CD8+T细胞分化、记忆细胞形成中不可或缺。但与功能健全的效应细胞和记忆T细胞相比，耗竭T细胞的IRF4和BATF表达增高，并可促进PD
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1等抑制性受体的表达，还可抑制记忆T细胞分化所需转录因子TCF1的表达，损害效应细胞的功能和分化潜能。我们前期通过TCGA数据库分析发现IRF4高表达的CLL患者疾病进展快生存期短，反之，IRF4低表达的疾病稳定和生存时间显著延长。临床研究发现抑制IRF4可促进TCF1和CD62L的表达增高，与TIM
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3等免疫抑制受体表达呈负相关，有助于恢复抗原特异性T细胞的功能，并促进了记忆T细胞的分化发育。
[0005]因此，基于TCF1和IRF4表达的微妙调控和制约，并对T细胞分化和免疫功能的调节作用的研究发现，检测TCF1及IRF4表达是一种很有前景的疗效预测和预后判断指标，并可作为肿瘤免疫治疗的调控靶点。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供了TCF1
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IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
TCF1
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IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用，
①
当TCF1的表达水平＜0.67且IRF4的表达水平≥1.99时，CLL患者疾病进展快、临床预后差的可能性较大；
②
当TCF1的表达水平＜0.67或IRF4的表达水平≥1.99时，CLL患者疾病进展快、临床预后差的可能性相对较大；
③
当TCF1的表达水平≥0.67且IRF4的表达水平＜1.99时，CLL患者疾病稳定、临床预后好的可能性较大。
[0008]进一步地，所述预测CLL疾病预后试剂盒中，包括用于扩增TCF1 cDNA的引物和用于扩增IRF4 cDNA的引物，其中，用于扩增TCF1 cDNA的引物如下：TCF7 (F): 5'
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TCCACCACAGGAGGAAAAAGA
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3'；TCF7 (R): 5'
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CGCAGGGCTAGTAAGCAGTT
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3'；用于扩增IRF4 cDNA的引物如下：IRF4 (F): 5'
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CGAGAAGGCATCGACAAGCC
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3'；IRF4 (R): 5'
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ATGGACATCTGCGGGTCCTC
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3'。
[0009]进一步地，所述预测CLL疾病预后试剂盒中，还包括：用于扩增内参的引物，具体如下:GAPDH (F): 5'
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GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA
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3'；GAPDH (R): 5'
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GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
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3'。
[0010]进一步地，还包括：用于分离外周血单个核细胞的试剂、用于总RNA提取的试剂、用于逆转录PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT
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PCR)的试剂、用于实时定量PCR (quantitative real time PCR, qRT
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PCR)的试剂中的任意一种或至少两种。
[0011]进一步地，所述的用于分离骨髓单个核细胞的试剂为淋巴细胞分离液（Ficoll）。
[0012]进一步地，所述的用于总RNA提取的试剂为TRIZOL。
[0013]进一步地，本专利技术所述预测CLL疾病预后试剂盒可用于非诊断检测TCF1
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IRF4表达，使用时，包括如下步骤：S1、取待测骨髓样本，分离得到单个核细胞；S2、在步骤S1得到的单个核细胞中加入总RNA提取的试剂，混匀；S3、加入氯仿，混匀后进行离心；S4、吸取上层液体，加入异丙醇后离心去上清；S5、乙醇洗涤，干燥，得到RNA样品；S6、将步骤S5得到的RNA样品逆转录成cDNA；S7、将步骤S5得到的cDNA，利用所述的试剂盒进行目的基因表达量检测。
[0014]9、如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的单个核细胞、总RNA提取的试剂、氯仿的配比按5～10
×
106个细胞：1毫升：0.1～0.3毫升计算；所述的总RNA提取的试剂为TRIZOL；步骤S3中，所述的离心的条件为：温度2～8℃、转速10000～15000g、时间15～30分
钟；步骤S4中，所述的异丙醇的用量优选按上层液体：异丙醇=体积比1～2:1～2计算；优选按1:1计算；离心的条件为：温度2～8℃、转速10000～15000g、时间10～20分钟；步骤S5中，所述的乙醇洗涤的次数两次，第一次用75%乙醇在
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20℃条件下洗涤，第二次用100%乙醇在
‑
20℃条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.TCF1
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IRF4在制备预测CLL疾病预后试剂盒中的应用，其特征在于：
①
当TCF1的表达水平＜0.67且IRF4的表达水平≥1.99时，CLL患者疾病进展快、临床预后差的可能性较大；
②
当TCF1的表达水平＜0.67或IRF4的表达水平≥1.99时，CLL患者疾病进展快、临床预后差的可能性相对较大；
③
当TCF1的表达水平≥0.67且IRF4的表达水平＜1.99时，CLL患者疾病稳定、临床预后好的可能性较大。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预测CLL疾病预后试剂盒中，包括用于扩增TCF1 cDNA的引物和用于扩增IRF4 cDNA的引物，其中，用于扩增TCF1 cDNA的引物如下：TCF7 (F): 5'
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TCCACCACAGGAGGAAAAAGA
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3'；TCF7 (R): 5'
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CGCAGGGCTAGTAAGCAGTT
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3'；用于扩增IRF4 cDNA的引物如下：IRF4 (F): 5'
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CGAGAAGGCATCGACAAGCC
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3'；IRF4 (R): 5'
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ATGGACATCTGCGGGTCCTC
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3'。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述预测CLL疾病预后试剂盒中，还包括：用于扩增内参的引物，具体如下:GAPDH (F): 5'
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GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA
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3'；GAPDH (R): 5'
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GACAAGCTTCCCGTTCTCAG
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3'。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述预测CLL疾病预后试剂盒中，还包括：用于分离外周血单个核...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹青松，梁桃桃，汪小姣，艾昊，王倩，
申请(专利权)人：河南省肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：