一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A及制备方法，属于生物制品的提取制备技术领域。红曲素A为红色粉末，分子式为C

【技术实现步骤摘要】
一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A及制备方法


[0001]本专利技术属于生物制品的提取制备
，具体涉及具有糖苷酶抑制活性的红曲素A、(Monascuskaolin A)的提取、纯化、结构鉴定和活性测定。

技术介绍

[0002]红曲霉(Monascus sp.)是一类小型丝状腐生真菌，属于真菌门(Eumycophyta)、子囊菌亚门(Ascomycotina)、不整囊菌纲(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)，红曲霉属(Monascus)，包括的种类有紫红曲霉(Monascus purpureus)、安卡红曲霉(Monascus anka)和红色红曲霉(Monascus ruber)。红曲霉可产生糖化酶、酯化酶、蛋白酶等多种酶类物质，在这些酶的协同作用下，能够生成单糖、氨基酸、核苷酸等呈味物质和挥发性酸类、醇类和酯类等香气物质，对发酵食品的风味贡献卓著。
[0003]近年来，由于生活水平提高和运动量减少，糖尿病患者人数逐年升高，目前世界糖尿病患者已达4.4亿人，并且每年以5％的比例增加，而目前降糖药种类较少，选择余地小，亟需研发新高效降糖药物。开发相关药物具有巨大的社会效益和经济效益。
[0004]当今社会快速发展，生活和工作节奏快、压力大，同时由于缺乏运动锻炼以及熬夜看手机等不良习惯，使得免疫紊乱的亚健康人群逐年增多，因此有必要开发免疫调节相关药物。红曲霉作为一种食品微生物，具有安全可靠的优点，因此相关免疫制剂及降糖制剂更具有应用潜力和巨大的经济价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A，同时提供红曲素A的制备方法。
[0006]一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A是从红曲霉(Monascus sp.)培养物中分离制备得到的红曲素A，结构式如下：
[0007][0008]红曲素A为红色粉末，分子式为C
25
H
32
O7，具有抑制糖苷酶活性；对α
‑
糖苷酶(α
‑
glycosidase)的半数抑制浓度(IC
50
)为220μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL
‑
1β、TNF
‑
α、和TGF
‑
β的转录水平具有显著下调的作用：IL
‑
1β(0.01
±
0.01)、TNF
‑
α(0.02
±
0.01)、和TGF
‑
β(0.03
±
0.01)相对于DMSO对照组变化显著P＜0.05；
[0009]所述的红曲霉为紫红曲霉(Monascus purpureus)或安卡红曲霉(Monascus anka)或红色红曲霉(Monascus ruber)。
[0010]一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A的制备操作步骤如下：
[0011](1)制备固体培养物
[0012]将红曲霉(Monascus sp.)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；
[0013](1.1)一级菌种培养
[0014]将红曲霉孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液10～30μL，于温度32～35℃、220～250r/min条件下，培养7～9天，得到一级菌种；
[0015](1.2)二级种子培养
[0016]将一级菌种用无菌水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每瓶200～250μL接种至250mL的PDB培养基中，在温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，摇瓶培养3～5天，得液体二级菌种；
[0017](1.3)三级液体扩大培养
[0018]取1～3mL液体二级菌种接种至250mL的PDB培养基中，在温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，摇瓶培养7～9天，收集培养物，得到液体培养物；
[0019](2)液体培养物中有效成分的提取和精制
[0020]提取和精制所用提取剂由甲醇和乙酸乙酯按体积比0～1：1～0混合均匀制成；
[0021]具体操作如下：
[0022](2.1)液体培养物中有效成分的提取
[0023]液体培养物经减压浓缩和干燥；用提取剂进行超声提取，滤膜过滤或离心分离，减压蒸发去除溶剂，得到有效成分提取物；
[0024](2.2)提取物的初步纯化
[0025]采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色的初步纯化物；
[0026](2.3)初步纯化物的精制
[0027]采用半制备型反相高效液相色谱对初步纯化物进行精制，在乙腈溶液洗脱条件下，收集最高的峰值对应的化合物，为红曲素A洗脱液，得到红色的红曲素A。
[0028]进一步的制备技术要求如下：
[0029]步骤(1.1)中，PDA培养基即马铃薯葡萄糖培养基，配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖和15g琼脂，加水至1000mL。
[0030]步骤(1.2)和(1.3)中，PDB培养基配方为：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖，加水至1000mL。
[0031]步骤(2.1)中，将液体培养物在真空度
‑
0.1～
‑
0.08MP、温度10～60℃条件下，减压浓缩到原体积的3/10～1/10，在温度
‑
50～130℃条件下干燥，粉碎后，按重量体积比1g：0.5～5mL加入提取剂，40KHz超声提取20～200分钟；在4000～15000转/分钟条件下，离心或0.1～2.5μm膜过滤，得滤液或离心上清；滤液或离心上清在真空度
‑
0.1～
‑
0.08MP、温度10～60℃条件下，减压蒸去提取剂，得到有效成分提取物。
[0032]步骤(2.2)中，采用制备型反相高效液相色谱进行精制；色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min 50％～70％流动相B梯度洗脱；进样体积30～300μL、柱温20～40℃、流速5～50mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：制备型反相
C
‑
18柱；收集第一最高峰对应的洗脱液，在真空度
‑
0.1～
‑
0.08MP、温度10～60℃条件下，减压蒸去提取剂，在小于等于130℃条件下干燥，得到红色的初步纯化物。
[0033]步骤(2.3)中，色谱分离制备条件为：流动相A为超纯水，流动相B为乙腈；洗脱条件：0到30min用50％～70％流动相A洗脱；进样体积20～200μL、柱温20～40℃、流速2～20mL/min；检测波长为358nm；色谱柱：半制备型反相C...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A，其特征在于：是从红曲霉(Monascus sp.)培养物中分离制备得到的红曲素A，结构式如下：红曲素A为红色粉末，分子式为C
25
H
32
O7，具有抑制糖苷酶活性；对α
‑
糖苷酶(α
‑
glycosidase)的半数抑制浓度(IC
50
)为220μg/mL，且对体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7的IL
‑
1β、TNF
‑
α、和TGF
‑
β的转录水平具有显著下调的作用：IL
‑
1β(0.01
±
0.01)、TNF
‑
α(0.02
±
0.01)、和TGF
‑
β(0.03
±
0.01)相对于DMSO对照组变化显著P＜0.05。2.根据权利要求1所述的一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A，其特征在于：所述的红曲霉为紫红曲霉(Monascus purpureus)或安卡红曲霉(Monascus anka)或红色红曲霉(Monascus ruber)。3.根据权利要求1所述一种具有抑制糖苷酶活性和免疫调节活性的红曲素A的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：(1)制备固体培养物将红曲霉(Monascus sp.)的菌种经过一级菌种培养、二级种子培养和三级液体扩大培养，得到液体培养物；(1.1)一级菌种培养将红曲霉孢悬液接种在土豆琼脂(PDA)斜面培养基上，每个斜面接种孢悬液10～30μL，于温度32～35℃、220～250r/min条件下，培养7～9天，得到一级菌种；(1.2)二级种子培养将一级菌种用无菌水配成浓度105～107个孢子/mL的孢悬液，按每瓶200～250μL接种至250mL的PDB培养基中，在温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，摇瓶培养3～5天，得液体二级菌种；(1.3)三级液体扩大培养取1～3mL液体二级菌种接种至250mL的PDB培养基中，在温度32～35℃、转速220～250r/min条件下，摇瓶培养7～9天，收集培养物，得到液体培养物；(2)液体培养物中有效成分的提取和精制提取和精制所用提取剂由甲醇和乙酸乙酯按体积比0～1∶1～0混合均匀制成；具体操作如下：(2.1)液体培养物中有效成分的提取液体培养物经减压浓缩和干燥；用提取剂进行超声提取，滤膜过滤或离心分离，减压蒸发去除溶剂，得到有效成分提取物；(2.2)提取物的初步纯化采用制备型反相高效液相色谱对有效成分提取物进行初步纯化，得到红色的初步纯化物；
(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡丰林，陆瑞利，黄永芳，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：