一种TaqDNA聚合酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种能进行快速PCR且耐受SYBR Green I的Taq DNA聚合酶突变体。本发明专利技术中筛选获得的Taq 01 DNA聚合酶突变体，在PCR和qPCR中均表现出快速PCR活性且更耐受SYBR Green I的活性。基于这些优势，该突变体可以在SYBR Green I等抑制剂存在的条件下进行快速PCR，从而在临床诊断和科学研究中可以更快的和更加灵敏的获得结果。和更加灵敏的获得结果。和更加灵敏的获得结果。

【技术实现步骤摘要】
一种TaqDNA聚合酶突变体


[0001]本专利技术涉及生物领域，并具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。

技术介绍

[0002]聚合酶链式反应(PCR)是一种应用十分广泛的体外扩增DNA技术。PCR自1985年问世以来，逐渐扩展到各个领域。除了在实验室分子生物学中运用，在临床疾病诊断和法医鉴定上也有着十分重要的作用。比如检测基因突变和微生物或病毒感染因子等，还比如可以进一步检测抗生素耐药基因和生物威胁剂。PCR的最早的诊断用途之一是用于镰状细胞贫血的产前诊断试验。使用PCR检测镰状细胞突变比以前的方法更快速和敏感。随后进行了更多基于PCR的诊断，包括检测低拷贝数病毒靶点(如HIV)；通过检测结核分枝杆菌诊断肺结核的试验；以及用于检测胃肠道幽门螺杆菌的不同分离物。
[0003]1992年，Higuchi等人开发了实时PCR(qPCR)。这种增强的PCR方法通过荧光染料(如SYBR Green I)或荧光共振能量转移(FRET)探针实时检测反应过程中形成的产物量。有三种主要的FRET探针：5'核酸外切酶探针(TaqMan)、分子信标和FRET杂交探针。SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时发出荧光，而当它从DNA分子释放时荧光减弱。实时PCR使得反应中DNA的起始量和整个过程中DNA的产生量实现可视化。与传统的培养方法相比，基于PCR的检测方法具有速度快、特异性强、灵敏度高等优点。
[0004]PCR反应主要依赖于DNA聚合酶。最初PCR技术中扩增DNA的酶来源于大肠杆菌聚合酶的Klenow片段。PCR扩增可以在短短几小时内就产生数十亿个拷贝的分子。随后在一些嗜热细菌中分离出了几种非常耐热的DNA聚合酶，包括Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)和Pyrococcus furiosus(Pfu)。它们在95℃的高温下依旧不会失去活性。其中，Taq DNA聚合酶是第一种应用于PCR的酶。它既有聚合酶活性又有外切酶活性。由于Taq DNA聚合酶高稳定性和高效性以及简单和经济的生产过程，这种聚合酶是大多数PCR应用中最受欢迎和最广泛使用的酶。
[0005]基于聚合酶链反应(PCR)的基因检测被广泛应用于疾病诊断和个性化医疗。但是，随着科学技术和社会的发展进步，临床诊断和科学研究中对于Taq DNA聚合酶的要求越来越高。这就暴露出它存在许多局限，包括DNA产量低、延伸DNA的长度短、聚合酶的速度慢、过程的保真度低和耐受性差等。具体而言，PCR检测通常涉及从血液和组织中提取基因组DNA，这增加了交叉污染的机会和完成检测所需的时间。直接在全血上进行的PCR反应又比较复杂，因为用于PCR的最常见的DNA聚合酶Taq在仅含0.2％全血的溶液中就完全被抑制。然而，在过去的20年里，各种直接从全血中实现高效PCR扩增的方法被开发出来。这些方法包括：
[0006](1)在初始变性步骤之前加入加热-冷却循环，或简单地增加一个较长的初始变性周期；
[0007](2)使用非Taq DNA聚合酶如rTth、Tfl、HotTub和Pwo；
[0008](3)能够逆转血液对Taq DNA聚合酶抑制作用的药物，如甜菜碱、牛血清白蛋白、单链DNA结合蛋白和蛋白酶抑制剂；
[0009](4)高pH反应缓冲液；
[0010](5)使用干血斑；
[0011](6)Taq突变体如KlenTaq。
[0012]目前已经发现了几种人血液中PCR的天然抑制剂，包括血红蛋白、免疫球蛋白G、乳铁蛋白和蛋白酶，但是它们的抑制机制尚不清楚。此外，全血中的抗凝血剂如EDTA和肝素也能抑制PCR反应。尽管一些特殊配方的缓冲液和酶试剂盒可直接用于全血PCR，但是这些工具非常昂贵，且耗费时间较长。
[0013]为了解决上述需求，可以从Taq DNA聚合酶本身着手去减小这些限制。其中一种就是在Taq DNA聚合酶突变体中筛选获得在某一方面具有优越性能的个体。而最有效、最快速的方法就是对Taq DNA聚合酶进行区域性自我复制筛选(即CSR高通量筛选)。
[0014]CSR主要基于一个反馈回路，每个聚合酶突变体都只能复制自己的编码基因。在利用易错PCR随机突变建立文库后，通过形成油包水乳剂在隔室中分离出聚合酶突变体。每个小室通常包含一个含有聚合酶突变体的表达型大肠杆菌细胞，这就提供了表型和基因型之间的联系，而这正是这一过程的关键。
[0015]当热循环导致细胞裂解时，PCR试剂也包含在隔室内并与表达的聚合酶结合。如果聚合酶突变体以活性酶的形式表达，或在压力条件下是有活性的，那么它将复制自己的基因，从而在热循环过程中增加编码活性聚合酶的基因的拷贝数。不能自我复制的不活跃的聚合酶将从基因库中逐渐减少最终消失。
[0016]以这种方式进行几轮甚至十几轮的筛选和富集最终获得想要的突变体聚合酶。
[0017]这个筛选过程中可以设置各种各样的压力来筛选不同突出性能的个体来满足不同的实验要求。比如1)在CSR过程中，通过逐步降低循环数和延伸时间，来筛选能够在短时间内即可扩增出大量产物的突变体，或者2)在CSR过程中，逐轮增加PCR抑制剂浓度如SYBR Green I、肝素和SDS等，来筛选耐抑制剂的突变体，或者3)在CSR过程中，添加易形成二聚体的引物来筛选具有热启动活性的个体，或者4)在CSR过程中，加入能够阻断聚合进程的修饰引物筛选具有高外切酶活性的个体，从而应用于qPCR中高效切除探针，以提高检测的灵敏度。
[0018]在这些研究的过程中，许多不同突变的Taq DNA聚合酶被创造和研究，以一种或另一种方式改善这种酶的性质，包括提高酶的保真度，改变5'-3'核酸外切酶活性，提高酶分子与DNA的结合性，增强酶“冷敏感性”或增加酶对不同PCR抑制剂的耐受性。这些Taq DNA聚合酶突变体可用于qPCR、DNA测序、扩增含有各种PCR抑制剂(染料、血液、土壤)的DNA样品。例如，在qPCR中使用的SYBR Green I染料，它可以抑制Taq DNA聚合酶活性，降低PCR的效率和灵敏度。聚合酶对SYBR Green I的耐受性增加可能与血液和土壤中对其他PCR抑制剂的酶耐药性增加有关。
[0019]目前，在临床诊断和科学研究过程中，人们最期望能提高的就是PCR的速度和耐抑制。因为在临床诊断过程中DNA来源的复杂性、纯化过程的耗时性以及PCR过程对诊断的时效性有着极大的影响，有些病人或者疾病要求在短时间内就做出准确的判断以便后续的检查和用药。并且由于DNA来源的复杂性，其中包含了许多抑制PCR反应的物质，而大部分是针对Taq DNA聚合酶的。目前采用的方法是将Taq DNA聚合酶用特异性的抗体修饰以提高其耐受性，但是抗体修饰耗时耗力，科学家希望找到更快速更经济的方法。而对Taq DNA聚合酶
进行随机突变，从突变体库中获得具有快速PCR活性和耐抑制的个体是最经济快速的方法。目前，科学家们也筛选获得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Taq DNA聚合酶，其包含选自以下位点中至少一个突变、任选地至少两个突变或者全部突变：Y24N、F27L和D144G。2.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶。3.根据权利要求2所述的分离的核酸，其中所述核酸包含选自以下位点中至少一个突变、任选地至少两个突变或者全部突变：T70A、T79C和A461G。4.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶或根据权利要求2-3中任一项所述的分离的核酸。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其为诊断试剂盒。6.一种PCR方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永有，郑华雷，刘本超，宋娜杰，
申请(专利权)人：厦门致善生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：