一种重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白的表达方法技术

本发明专利技术涉及一种重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白(抗过敏融合蛋白)的表达方法及用途。所述的重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白，其能够结合于肥大细胞和嗜碱粒细胞表面介导过敏反应的Fcε受体I(FcεRI)和抑制性Fcγ受体IIb(FcγRIIb)。本发明专利技术提供的重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白能够用于过敏疾病，如过敏哮喘、鼻炎等。鼻炎等。鼻炎等。

【技术实现步骤摘要】
一种重组人免疫球蛋白
ε
和
γ
的Fc融合蛋白的表达方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，涉及一种重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白(抗过敏融合蛋白)的表达方法及操作。

技术介绍

[0002]过敏是人体接触环境中的过敏原后，所引发的一系列过度反应的现象，包含过敏性鼻炎、食物过敏、荨麻疹、哮喘等。
[0003]即发性过敏反应(又称I型超敏反应)是IgE介导的免疫反应，是一类常见的过敏类型，主要可分为全身性过敏反应和异位性过敏反应两大类。
[0004]过敏产生的原理是：当过敏原(抗原)第一次接触免疫B细胞后，B细胞和T细胞接触而分化成浆细胞并产生大量抗体IgE，这些IgE会与肥大细胞等免疫细胞结合，当下一次接触过敏原时，IgE结合的免疫细胞被激活，免疫细胞释放组胺等物质，引起过敏症状并影响免疫反应。
[0005]1995年，法国的科研小组Daeron等首次报道了介导肥大细胞活化的IgE高亲和力受体(Fc
ε
RI)受到低亲和力IgG受体(Fc
γ
RII)的负调控，同一多价配体交联肥大细胞表面的Fc
ε
RI和Fc
γ
RII可以抑制细胞的活化，阻止介体的释放[Daeron M,Malbec O,Latour S,Arock M,Fridman W.Regulation of high-affinity IgEreceptor-mediated mast cell activation by murine low-affinity IgG receptors.J Clin Invest,95:577-585,1995.]，在当时的文献中，并未关注不同种类的Fc
γ
RII存在区别。这一区别在之后的研究中被发现。
[0006]WuJ.等人的研究表明，Fc
γ
RII一族单抗在过敏反应中扮演着重要角色，Fc
γ
RII可进一步细分为 Fc
γ
RIIa，Fc
γ
RIIb，Fc
γ
RIIc。其中对IgE有负调控作用的受体是Fc
γ
RIIb，Fc
γ
RIIa与特异性反应呈现正相关，其他的受体与特异性反应及哮喘没有明显关联[Wu J,Lin R,Huang J,Guan W,Oetting WS,et al.(2014) Functional Fcgamma Receptor Polymorphisms Are Associated with Human Allergy.PLoS ONE9(2):e89196. doi:10.1371/journal.pone.0089196.]。其中Fc
γ
RIIa为人类独有。在Fc
γ
RII一族中，Fc
γ
RIIb与IgG的亲和力较Fc
γ
RIIa及Fc
γ
RIIc为低。
[0007]随着研究的深入进行，人们发现不同种类的Fc
γ
RII受体其在体内作用存在的差异相当明显。Rosales C. 等人的研究进一步证实了不同受体的调控作用截然相反。[Rosales C.FcγReceptor Heterogeneity inLeukocyte Functional Responses.Front Immunol.2017；8:280.Published 2017Mar 20. doi:10.3389/fimmu.2017.00280.]在人体中，Fc
γ
RIIb受体可以激活胞内链上的免疫受体酪氨酸抑制基序 (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif，ITIM)，它也是唯一能激活ITIM的受体，而FC
γ
RIIa与 FC
γ
RIIc则会激活胞内链上的免疫受体酪氨酸活化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif, ITAM)，这与IgE相同的活化效果将会导致SYK(蛋白脾酪氨酸激酶)活性化，加重哮喘的症状。
[0008]王静娴的研究证实[王静娴.鼠源AAFP(Anti-allergy fusionprotein，简称AAFP)蛋白对IgE介导小鼠过敏反应的干预作用及机制研究[D].贵阳:贵阳医学院,2014.]，通过交联Fc
ε
RI和Fc
γ
RIIb受体，激活 Fc
γ
RIIb受体胞内链上的ITIM抑制基序，进一步激活5'-肌醇磷酸酶(SHIP)的磷酸化，SHIP磷酸化使得 Fc
ε
RI信号途径中的关键信号蛋白脾酪氨酸激酶(Syk)脱磷酸化，阻断Syk启动的细胞脱颗粒作用。AAFP 蛋白作用于过敏细胞的活化和炎性介质的释放，以此来抑制IgE介导过敏反应的发生。
[0009]抗过敏融合蛋白AAFP由人源Fc
ε
和Fc
γ
构成，可以交联肥大细胞和嗜碱粒细胞表面介导过敏反应的 Fc
ε
受体I(Fc
ε
RI)和抑制性Fc
γ
受体IIb(Fc
γ
RIIb)，抑制肥大细胞和嗜碱粒细胞的活化及过敏炎性介质的释放，从而有效阻断过敏的发生。
[0010]近年来，市场上对于IgE介导过敏性疾病生物药物的研究开发主要集中于抗IgE或抗Fc
ε
RI单克隆抗体和抑制其信号传导两大类。不过临床研究发现，体内IgE水平的降低会导致肿瘤发生率的增加。而AAFP 并不是单纯地与IgE抗体结合，因此AAFP没有减少体内IgE抗体的含量，不会因为IgE抗体在体内含量的降低而引起不良后果，相较于抗IgE单克隆抗体相对安全，为IgE介导过敏性疾病的治疗开辟了新的途径。
[0011]生物学中，表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、增强子、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。表达载体主要分为四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
[0012]表达载体常用细菌质粒构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端(多为黏性末端，也有平末端)，再采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。
[0013]CHO细胞(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)是目前重组蛋白药物的生产的常用体系，与其他表达系统相比具有许多优点：(1)具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化；(2)具有重组基因的高效扩增和表达能力；(3)具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，也可进行悬浮培养，表达水平较高；(4)CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离； (5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白，其特征在于，重组人免疫球蛋白ε和γ的Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由权利要求1所述的核苷酸序列编码表达获得。3.一种权利要求2所述融合蛋白的表达方法，包括如下步骤：构建重组质粒，导入CHO细胞中，经筛选获得阳性克隆，表达融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国栋，付栋君，王亚倩，李杰，
申请(专利权)人：上海景峰制药有限公司，
类型：发明
国别省市：