一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术技术领域，具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。所述的方法包括：菌种培养、接种、扩繁、诱导表达、破碎离心、干燥，即得禽白血病P27蛋白。本发明专利技术提供的优点：禽白血病P27蛋白表达浓度高、表达量大。禽白血病P27蛋白产量高、表达量和产量稳定。生产周期短且成本低，生产效率高。稳定性和重复性好，适于规模化生产。适于规模化生产。适于规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物技术
，具体涉及一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。

技术介绍

[0002]禽白血病是一类由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)引起的禽类不同组织良性和恶性肿瘤病的总称。该病毒为反转录病毒科的α反转录病毒属，可分为A～J共10个亚群。ALV主要引起感染鸡在性成熟前后发生肿瘤死亡，感染率和发病死亡率高低不等，死亡率最高可达20％。一些鸡感染后虽不发生肿瘤，但可造成产蛋性能下降甚至免疫抑制。控制此类疾病主要是通过种群净化来切断垂直传播，种鸡群一旦发ALV现阳性，应及时淘汰以阻断水平传播。
[0003]P27蛋白是禽白血病病毒重要的蛋白，是禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检的必须材料，通常采用基因工程菌株三角摇瓶小规模表达P27蛋白。表达禽白血病P27蛋白有过很多报道，应用的表达系统有大肠杆菌、杆状病毒表达系统，但是均是小量表达，单位体积一般在300ml～1000ml，表达量在40mg/L左右；表达浓度低；经过纯化后，产量最该仅能达到80mg/批次；并且存在较大的批间差异，每次表达量和产量都不稳定，不仅耗时费力且产品满足不了试剂盒生产和质检的需求。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种表达浓度高、表达量大、蛋白产量高、表达量和产量稳定、生产周期短且成本低的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法及其应用。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
[0007]S101菌种培养：
[0008]重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
[0009]挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃，培养10～12h，得一级种子；
[0010]一级种子按1～3％接种量(V：V)接种于液体LB培养基中，37.0℃，培养10～12h，得二级种子；
[0011]S102接种：
[0012]二级种子按接种量(V：V)3～7％接种于发酵罐培养基中；
[0013]S103扩繁：
[0014]接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，pH为7.0，溶氧量25～35％，培养4～6h；
[0015]S104诱导表达：
[0016]扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；
[0017]S105破碎离心：
[0018]诱导表达结束后，发酵罐中的菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
[0019]进一步的，所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)
‑
pET
‑
30a
‑
p27。
[0020]进一步的，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4·
12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000
×
微量元素混合液。
[0021]进一步的，所述的1000
×
微量元素混合液为1M CaCl
2 2ml、1M MnSO
4 1ml、1M ZnCl
2 1ml、0.2M CoCl
2 1ml、0.1M CuSO
4 2ml、0.2M NiSO
4 1ml、0.1M Na2MoO
4 2ml、0.1M Na2SeO
3 2ml、0.1M H3BO
3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl
3 50ml混合即得。
[0022]进一步的，所述的诱导剂为IPTG，其在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mmol/L。
[0023]进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至2h流加补料培养基一，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
[0024]所述的补料培养基一为10～30％的甘油。
[0025]进一步的，所述的步骤S103扩繁中，菌种培养至3.5～4h流加补料培养基二，流加速度为3mL/min，连续流加至培养结束；
[0026]所述的补料培养基二的组成为10～30％蛋白胨和10～30％酵母粉。
[0027]本专利技术还提供另外一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法。
[0028]一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，所述的方法包括：
[0029]S201菌种培养：
[0030]重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)
‑
pET
‑
30a
‑
p27菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；
[0031]挑取培养平板上的单菌落于LB液体培养基35～40℃摇床培养过夜；
[0032]摇床培养液按1％接种量(V：V)接种于LB液体培养基，35～40℃，200r/min培养4h，得种子液；
[0033]S202扩繁：
[0034]种子液按接种量(V：V)3～7％接种于LB液体培养基中，振荡培养至OD
600nm
值为0.6
‑
0.8；
[0035]S203诱导表达：
[0036]向扩繁液中加入终浓度为0.8～1.2mmol/L的IPTG诱导剂，调节pH至6.8～7.2，35～40℃培养诱导表达4～6h；
[0037]S204破碎离心：
[0038]诱导表达结束后，菌液进行细胞破碎，破碎后的菌液4℃、12000rpm/min离心40min，上清液过滤后干燥，即得禽白血病P27蛋白。
[0039]进一步的，所述的LB平板、LB培养基和发酵罐培养基含有硫酸卡那霉素，硫酸卡那霉素在培养基/培养液中的终浓度为0.5g/L。
[0040]本专利技术还提供一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
[0041]一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于高效表达禽白血病P27蛋白。
[0042]本专利技术还提供另一种高效表达禽白血病P27蛋白方法的应用。
[0043]一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，用于禽白血病检测试剂盒研发、生产和质检。
[0044]本专利技术提供的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法利用重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)
‑
pET
‑
30a
‑
p27作为菌种，建立了表达P27蛋白的重组大肠杆菌高密度表达的培养工艺，并对表达产物进行了亲和层系纯化，成功制备了P27蛋白。在高密度发酵阶段，菌体密度的大小直接影响最终目的产物的产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：S101菌种培养：重组大肠埃希杆菌BL21菌种培养得二级种子；S102接种：二级种子接种于发酵罐培养基中；S103扩繁：接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，溶氧量25～35％，培养4～6h；S104诱导表达：扩繁后的发酵罐中加入诱导剂，35～40℃，培养4～6h；S105破碎离心：得禽白血病P27蛋白。2.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的重组大肠埃希杆菌BL21为重组大肠埃希杆菌BL21(DE3)
‑
pET
‑
30a
‑
p27。3.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于，所述的发酵罐培养基的组成为：1％酵母粉、1％胰蛋白胨、1％甘油、0.4％KH2PO4、0.2％K2HPO4、0.7％Na2HPO4
·
12H2O、0.1％MgSO4、0.3％NH4Cl、0.02％1000
×
微量元素混合液。4.根据权利要求3所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的1000
×
微量元素混合液为1M CaCl2 2ml、1M MnSO4 1ml、1MZnCl2 1ml、0.2M CoCl2 1ml、0.1M CuSO4 2ml、0.2M NiSO4 1ml、0.1M Na2MoO42ml、0.1M Na2SeO3 2ml、0.1M H3BO3 2ml混合后121℃、20min高压灭菌后与过滤除菌后的0.1M FeCl3 50ml混合即得。5.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述的诱导剂为IPTG，其在发酵液中的终浓度为0.8～1.2mmol/L。6.根据权利要求1所述的一种高效表达禽白血病P27蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：S101菌种培养：重组大肠埃希杆菌BL21菌种涂板于LB平板，35～40℃培养过夜；挑取培养平板上的单菌落于10mL LB液体培养基37℃，培养10～12h，得一级种子；一级种子按1～3％接种量(V:V)接种于液体LB培养基中，37.0℃，培养10～12h，得二级种子；S102接种：二级种子按接种量(V:V)3～7％接种于发酵罐培养基中；S103扩繁：接种后的发酵罐调节温度35～40℃，转速300～600rpm，pH为7.0，溶氧量25～35％，培养4～6h；S104诱导表达：扩繁后的发酵...

【专利技术属性】
技术研发人员：王云峰，王牟平，高玉龙，康志勇，董明奇，吴晓婵，谢小明，刘文，韩庆安，马宏伟，顾文源，
申请(专利权)人：哈尔滨国生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：