一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像方法，DMD作为数字闪耀光栅对不同波长的激光进行衍射，傅里叶滤波产生的正负一级衍射光经过精确的偏振调制后在待测荧光样品表面干涉生成高对比度的条纹照明图案，通过DMD加载不同方向和相位的条纹图案快速地对干涉条纹进行方向旋转和相位移动，对获得的多幅原始荧光强度图像进行重构得到超分辨显微图像。本发明专利技术还公开了基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像装置，用振镜快速切换不同的激光波长选通或截止进入到不同的方芯多模光纤内，通过调节方芯多模光纤输出端进行各波长入射角度的对准，从而保证各波长对应的闪耀级次落在同一位置以便于傅里叶滤波。装置复杂度低，灵活度、稳定性、可扩展性高，同时采用模块化设计使系统可扩展应用于三维干涉型结构光照明显微技术和投影型结构光照明显微技术的成像研究。的成像研究。的成像研究。

【技术实现步骤摘要】
一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像方法和装置


[0001]本专利技术属于光学超分辨荧光显微成像领域，特别涉及一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像方法和装置。

技术介绍

[0002]在超分辨荧光显微成像领域，目前主流的三种技术大类分别是受激辐射损耗技术、单分子定位技术和结构光照明技术。受激辐射损耗技术属于点扫描技术，通过叠加激发光和损耗光的点扩散函数实现超分辨，目前最高可获得20nm的分辨率，但它要求荧光标记密度较高，同时需要高的光功率，会对样品造成较为严重的光漂白现象。单分子定位技术和结构光照明技术都属于宽场成像技术，其中单分子定位技术利用特殊荧光染料的稀疏发光特性，通过拍摄大量稀疏分布的单分子图片并结合后期的拟合定位算法最终重构出一张超分辨图像，它可将分辨率提升至10nm量级，但需要特殊染料，而且成像速度慢。结构光照明技术则是通过在傅里叶域对图像频谱进行处理，将普通显微镜无法观测到的高频分量移动到低频范围内从而获取样品的精细结构，虽然它只能将分辨率提高到100nm左右，但与其他两种方法相比，它需要的光功率低，无需特异荧光染料，成像速度快，在生物研究特别是活细胞成像领域很受欢迎。
[0003]传统的结构光照明需要平移(至少三次)和旋转(至少三次)物理光栅获得各向同性的分辨率，限制了成像的速度和精度。随着铁电液晶空间光调制器的出现，研究者们开始用这种数字型光栅代替传统的物理光栅，通过加载需要的图案来实现方向旋转和相位移动，大大提高了结构光照明技术的速度和精度，然而它对偏振敏感且价格比较昂贵。基于CMOS(互补金属氧化物半导体)技术的DMD是一种对偏振不敏感且价格便宜的空间光调制器，它的图案刷新速率也更快(可以达到10KHz)，因此近年来开始被应用到结构光照明显微成像领域。
[0004]DMD由微镜阵列组成，每个微镜都可以单独翻转到两个大小相等方向相反的角度，分别对应“开”状态和“关”状态，因此它用作光栅时是一种闪耀光栅。在基于DMD的多色结构光照明成像中需要保证每个波长的激光光束经DMD衍射产生的闪耀级落在同一个位置，即射入DMD的各光束经衍射后共心共轴。一种实现方法对前期的仿真依赖性较高，需要在保证各波长的衍射角相同的前提下，计算得到每个波长对于选定DMD的闪耀级次和入射角度，仿真得到的结果用来指导后期实验光路的搭建。该方法在Peter等人，生物医学光学快报(Biomedical Optics Express)，12(6)，3700
‑
3716(2021)中进行了研究。在该方法中，所选用的三个波长分别为465nm、532nm和635nm，仿真得到的入射角度大小分别为45.20
°
、2.09
°
和45.89
°
,三个波长的衍射角度大小均为21.20
°
。实验光路中各波长激光入射角度的对准通过双轴音圈镜(dual
‑
axis voice
‑
coil mirror)来实现，但双轴音圈镜的角度范围有限(
±
25
°
)，不利于扩展到更多色的成像应用，而且其有限的扫描速度(20Hz)会限制成像速度，另外系统复杂度高、灵活性低。
[0005]另一种实现方法是通过硬件精密地调节各波长的激光，从而保证射入DMD的各光
束经衍射后共心共轴。现有公开号CN109407295A的申请文件提供的一种基于DMD可多色激发的结构光显微系统体现了这种方法。该系统中，DMD前依次设置多色耦合模块和多色偏角模块，多色耦合模块将至少两种波长的光源耦合于同一光路中，使各波长的光束共心共轴，并选择不同波长的光源分时输出，多色偏角模块用于产生特定的角度偏移和纵向位移偏差补偿，使得不同波长的不同衍射级光束经过DMD衍射后实现多波长光束共心共轴，包括用于使射入的光束产生预置偏角的角度补偿单元(闪耀光栅)和用于使射入的光束产生垂直于光轴方向位移的位移补偿单元(电控平移台)。这种方法对硬件的精密度要求较高，而且装置价格昂贵。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像方法和装置，利用振镜摆动不同的角度实现对各波长激光的分时选通或截止，通过调整等距排列的方芯多模光纤头之间的距离和它们与振镜之间的距离，可以无限增加激光波长的选通数，通过调节各光纤输出端的二维调节架实现各波长激光入射角度的对准，从而保证各波长对应的闪耀级能够重合，以同一衍射角出射DMD，通过在傅里叶面处对三个衍射级次(零级和正负一级)的滤波处理和偏振调制，偏振方向相同的正负一级衍射光在样品面干涉形成高对比度的条纹照明图样，通过DMD上加载不同的图案改变条纹图样的方向和相位，从而实现多色结构光照明超分辨显微成像。该种方法成像速度快，装置复杂度低、灵活度高、稳定性高，特别适用于生命科学领域尤其是活细胞研究中对荧光样品进行成像。
[0007]为实现上述的专利技术目的，本专利技术所采用的具体技术方案如下：
[0008]一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，所述激发光路模块具有依次布置的：
[0009]多色激光器，发出不同波长的线偏振激光光束用于激发荧光；
[0010]振镜单波长选通系统，用于快速选通或截止所述多色激光器发出的单个波长激光；
[0011]方芯多模光纤组，用于传输选通的各个波长的激光以入射到DMD上，并调整各波长激光的输出方向到满足DMD数字闪耀光栅闪耀条件的角度，并将入射的线偏振光转换为圆偏振光；
[0012]DMD，用作数字闪耀光栅，对入射的各个波长的激光进行衍射，并控制干涉条纹的方向和相位的改变；
[0013]傅里叶滤波系统，用于各个方向下衍射产生的零级光的滤除和正负一级光的通过，并将各方向下的正负一级衍射光由圆偏振光转换为偏振方向相同的线偏振光；
[0014]显微物镜，用于将各方向下的偏振方向相同的正负一级衍射光聚焦到待测荧光样品表面进行干涉，产生条纹图样照明荧光样品，并收集发出的荧光强度信号。
[0015]本专利技术的装置采用模块化设计为系统预留了多功能应用接口，可以方便地接入与已有两束干涉光等光程的一路光作为第三束干涉光改装成三维干涉型结构光照明显微成像装置，还可以接入投影型结构光照明显微成像模块。装置采用振镜摆动不同角度的方法来实现不同波长激光的选通和截止；采用调节方芯多模光纤输出端的方法来实现各波长入射角度的对准；采用傅里叶滤波的方法来实现零级衍射光的遮挡和正负一级衍射光的通
过；采用四分之一波片配合多方向偏振片的方法来保证各方向相对的两束干涉光是偏振方向相同的线偏振光，以保证最高的条纹对比度。
[0016]作为优选的，所述振镜单波长选通系统包括沿光路依次设置的：第一透镜、变形镜、第二透镜、第三透镜、振镜和方芯多模光纤头夹具；所述第一透镜用于将激光光束缩束入射到所述变形镜的有效面积内；所述变形镜用于对入射激光光束进行高频振动使激光强度均匀化；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DMD的多色结构光照明超分辨显微成像装置，包括激发光路模块和成像光路模块，其特征在于，所述激发光路模块具有依次布置的：多色激光器，发出不同波长的线偏振激光光束用于激发荧光；振镜单波长选通系统，用于快速选通或截止所述多色激光器发出的单个波长激光；方芯多模光纤组，用于传输选通的各个波长的激光以入射到DMD上，并调整各波长激光的输出方向到满足DMD数字闪耀光栅闪耀条件的角度，并将入射的线偏振光转换为圆偏振光；DMD，用作数字闪耀光栅，对入射的各个波长的激光进行衍射，并控制干涉条纹的方向和相位的改变；傅里叶滤波系统，用于各个方向下衍射产生的零级光的滤除和正负一级光的通过，并将各方向的正负一级衍射光由圆偏振光转换为偏振方向相同的线偏振光；显微物镜，用于将各方向的偏振方向相同的正负一级衍射光聚焦到待测荧光样品表面进行干涉，产生条纹图样照明荧光样品，并收集发出的荧光强度信号。2.根据权利要求1所述的多色结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述振镜单波长选通系统包括沿光路依次设置的：第一透镜、变形镜、第二透镜、第三透镜、振镜和方芯多模光纤头夹具；所述第一透镜用于将激光光束缩束入射到所述变形镜的有效面积内；所述变形镜用于对入射激光光束进行高频振动使激光强度均匀化；第二透镜和第三透镜组成4f系统，用于将激光光束的数值孔径扩大到所述方芯多模光纤的数值孔径值；所述振镜用于将大数值孔径的激光光束以不低于5kHz的频率快速地选通或截止输入到所述方芯多模光纤头夹具中等间距排列的多个光纤头的其中一个内。3.根据权利要求1所述的多色结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述方芯多模光纤组包括传输单波长激光的多根光纤，每根光纤的输出端具有调节架，用于将该波长的激光输出方向调节到仿真计算好的入射角度以达到最大衍射效率；每根光纤的出射光路上具有依次设置的透镜和四分之一波片，所述透镜用于将激光准直后入射到DMD上；所述四分之一波片用于将激光由线偏振光转换为圆偏振光。4.根据权利要求1所述的多色结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述DMD用作数字闪耀光栅，当各个波长的激光以仿真计算所得的各自的角度入射到DMD上时，将以同一衍射角度出离DMD。5.根据权利要求1所述的多色结构光照明超分辨显微成像装置，其特征在于，所述DMD的出射光路上设置有傅里叶滤波系统，包括依次设置的傅里叶滤波器和披萨偏振器，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡翠方，李小燕，徐良，刘旭，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：