一种细胞冻存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞冻存液及其制备方法和应用，包括以下组分：IMDM基础培养基、DMSO、4

【技术实现步骤摘要】
一种细胞冻存液及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种细胞冻存液及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]干细胞治疗是目前迅猛发展的一种非常有前景的治疗多种疾病的手段，而该技术的发展需要干细胞库建设为支撑，细胞的冷冻保存是其中的关键技术之一。冻存细胞时，细胞内外环境中的水会形成冰晶，导致细胞内发生一系列的理化变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变以及蛋白质变性等，严重时甚至会导致细胞死亡。因此，细胞冻存液需要添加甘油、DMSO等保护剂成分，以降低冰点，在缓慢降温条件下，使细胞内水分渗出细胞外，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。冻存液的优劣对冻存后细胞的质量有着举足轻重的影响。
[0003]间充质干细胞是一种多能的，具有自我更新能力的细胞，最早从骨髓中发现，可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉等组织。现在间充质干细胞不仅可以从骨髓中分离出来，也可从脂肪、脐带、胎盘等组织中分离出来。与骨髓相比，脐带来源广泛，便于取材，对供者不造成创伤以及无伦理道德制约，因此，人脐带间充质干细胞有着更加理想的发展前景。
[0004]人脐带间充质干细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要是采用添加适量保护剂的缓慢冷冻法来冻存细胞。目前，现有技术中普遍使用的细胞冻存液采用二甲基亚砜(DMSO)为保护剂。
[0005]DMSO是细胞保存中最常用的渗透型冷冻剂，DMSO可渗入细胞内，使水分渗出，降低细胞受冻存过程中形成的冰晶的损伤程度，但DMSO存在一定的毒性作用，能够与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性。因此，现有的冻存液(含10％DMSO的完全培养基)在保持细胞活力及复苏后增殖活性方面仍存在显著的不足。因此，寻找新的配方或联合其它成分，降低或消除DMSO对间充质干细胞(MSC)损害是目前一个重要的研究方向。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种细胞冻存液及其制备方法和应用，将冻存液用于冻存间充质干细胞，降低或消除DMSO对间充质干细胞(MSC)损害。本专利技术提供的冻存液能很好地保持细胞存活率和增殖活性。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0008]本专利技术的第一个目的在于提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液由多种成分组成，具体包括以下组分：IMDM基础培养基、DMSO(二甲基亚砜)、4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸吡哆醛、肌醇、腐胺、血清素、巯基乙醇、花生四烯酸、胆固醇、儿茶素、氯化胆硷、泛酸钙、烟酰胺、海藻糖、聚氧丙烯聚氧乙烯、吐温80、白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、Fisetin漆黄素、Piperlongumine荜茇酰胺、生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸。
[0009]优选的，所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、细胞因子、无机化合物和维生
素；
[0010]所述氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种；
[0011]所述激素为氢化可的松、黄体酮、地塞米松和胃动素中的至少一种；
[0012]所述抑制剂包括ROCK1抑制剂Y
‑
27632、GSK
‑
3抑制剂Laduviglusib、ALK
‑
5抑制剂A 83
‑
01、Dasatinib达沙替尼、BCL
‑
XL抑制剂A1331852和MEK抑制剂PD0325901中的至少一种；
[0013]所述细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子、人内皮素
‑
1、转化生长因子
‑
β1、白细胞介素
‑
1、白细胞介素
‑
6、干细胞生长因子、肝细胞生长因子和白血病抑制因子中的至少一种；
[0014]所述无机化合物包括CuSO4、ZnSO4、Na2SeO3、FeCl3、Na2SiO3、FeCl3、Na2SiO3、MnSO4、NH4VO3、NiSO4、SnCl2、AlCl3、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2、CrCl3、NaF、GeO2、钼酸、KI和碳酸氢钠中的至少一种；
[0015]所述维生素包括抗坏血酸、盐酸硫胺素、核黄素和叶酸中的至少一种。
[0016]本专利技术的第二个目的在于提供一种细胞冻存液，按照终浓度的组成包括：4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸0.5
‑
3mM/L、盐酸吡哆醛1
‑
3mg/L、肌醇0.05
‑
0.2mg/L、腐胺15
‑
25mg/L、血清素0.5
‑
1.5mg/L、巯基乙醇0.05
‑
0.2μM/L、花生四烯酸40
‑
60μg/L、胆固醇150
‑
250μg/L、儿茶素40
‑
60mg/L、氯化胆硷0.005
‑
0.02mg/L、泛酸钙0.05
‑
0.2mg/L、烟酰胺0.05
‑
0.2mg/L、海藻糖8
‑
12mM/L、聚氧丙烯聚氧乙烯60
‑
100mg/L、吐温80 1
‑
3mg/L、白蛋白1
‑
3g/L、转铁蛋白70
‑
130mg/L、纤维连接蛋白400
‑
600μg/L、Fisetin漆黄素80
‑
120μM、Piperlongumine荜茇酰胺0.05
‑
0.2μM、生育酚乙酸酯400
‑
600μg/L、亚油酸5
‑
15μg/L、亚麻酸160
‑
240μg/L、豆蔻酸8
‑
12μg/L、油酸150
‑
250μg/L、棕榈酸5
‑
15μg/L、棕榈油酸180
‑
220μg/L和硬脂酸150
‑
250μg/L；溶剂为IMDM基础培养基。
[0017]优选的，所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、无机化合物和维生素；按照终浓度的组成，所述氨基酸包括谷氨酸25
‑
35mM、精氨酸0.5
‑
2mM、胱氨酸0.005
‑
0.02mM、组氨酸0.5
‑
1.5mM、异亮氨酸0.005
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0.02mM、亮氨酸0.5
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1.5mM、赖氨酸0.005
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0.02mM、甲硫氨酸0.5
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1.5mM、苯丙氨酸0.005
‑
0.02mM、苏氨酸0.5
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液由多种成分组成，具体包括以下组分：IMDM基础培养基、DMSO(二甲基亚砜)、4
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羟乙基哌嗪乙磺酸、盐酸吡哆醛、肌醇、腐胺、血清素、巯基乙醇、花生四烯酸、胆固醇、儿茶素、氯化胆硷、泛酸钙、烟酰胺、海藻糖、聚氧丙烯聚氧乙烯、吐温80、白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、Fisetin漆黄素、Piperlongumine荜茇酰胺、生育酚乙酸酯、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸、油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸；所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、细胞因子、无机化合物和维生素。2.根据权利要求1所述冻存液，其特征在于，所述氨基酸包括谷氨酸、精氨酸、胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的至少一种；所述激素为氢化可的松、黄体酮、地塞米松和胃动素中的至少一种；所述抑制剂包括ROCK1抑制剂Y
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27632、GSK
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3抑制剂Laduviglusib、ALK
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5抑制剂A 83
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01、Dasatinib达沙替尼、BCL
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XL抑制剂A1331852和MEK抑制剂PD0325901中的至少一种；所述细胞因子包括碱性成纤维细胞生长因子、人内皮素
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1、转化生长因子
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β1、白细胞介素
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1、白细胞介素
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6、干细胞生长因子、肝细胞生长因子和白血病抑制因子中的至少一种；所述无机化合物包括CuSO4、ZnSO4、Na2SeO3、FeCl3、Na2SiO3、FeCl3、Na2SiO3、MnSO4、NH4VO3、NiSO4、SnCl2、AlCl3、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2、CrCl3、NaF、GeO2、钼酸、KI和碳酸氢钠中的至少一种；所述维生素包括抗坏血酸、盐酸硫胺素、核黄素和叶酸中的至少一种。3.一种细胞冻存液，其特征在于，按照终浓度的组成包括：4
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羟乙基哌嗪乙磺酸0.5
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3mM/L、盐酸吡哆醛1
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3mg/L、肌醇0.05
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0.2mg/L、腐胺15
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25mg/L、血清素0.5
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1.5mg/L、巯基乙醇0.05
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0.2μM/L、花生四烯酸40
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60μg/L、胆固醇150
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250μg/L、儿茶素40
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60mg/L、氯化胆硷0.005
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0.02mg/L、泛酸钙0.05
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0.2mg/L、烟酰胺0.05
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0.2mg/L、海藻糖8
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12mM/L、聚氧丙烯聚氧乙烯60
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100mg/L、吐温80 1
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3mg/L、白蛋白1
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3g/L、转铁蛋白70
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130mg/L、纤维连接蛋白400
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600μg/L、Fisetin漆黄素80
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120μM、Piperlongumine荜茇酰胺0.05
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0.2μM、生育酚乙酸酯400
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600μg/L、亚油酸5
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15μg/L、亚麻酸160
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240μg/L、豆蔻酸8
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12μg/L、油酸150
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250μg/L、棕榈酸5
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15μg/L、棕榈油酸180
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220μg/L和硬脂酸150
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250μg/L；溶剂为IMDM基础培养基。4.根据权利要求3所述冻存液，其特征在于，所述冻存液还包括氨基酸、激素、抑制剂、无机化合物和维生素；按照终浓度的组成，所述氨基酸包括谷氨酸25
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35mM、精氨酸0.5
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2mM、胱氨酸0.005
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0.02mM、组氨酸0.5
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1.5mM、异亮氨酸0.005
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0.02mM、亮氨酸0.5
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1.5mM、赖氨酸0.005
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0.02mM、甲硫氨酸0.5
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1.5mM、苯丙氨酸0.005
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0.02mM、酪氨酸0.5
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1.5mM、缬氨酸0.005
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0.02mM、甘氨酸0.1
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0.3mM、丙氨酸0.005
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0.02mM、天冬酰胺0.1
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【专利技术属性】
技术研发人员：任浩，姜舒，张芸，刘赢滢，谢亮，赵传鑫，李欣，纪惜銮，翁东旭，黄伟，李结明，
申请(专利权)人：深圳市茵冠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：