含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种含有该多肽的冷冻保存液及其在干细胞冷冻保存中的应用。其中，所述多肽是LEA蛋白的功能区，在水溶液中具有良好的生物相容性好，是理想的控冰材料。含有上述多肽的冷冻保存液用于冷冻保存干细胞具有较高的存活率，仅能达到常规冷冻液冷冻干细胞的有效性，且与目前普遍使用的含有10％的DMSO的商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当。商品化冷冻保存液的冷冻保存复苏率相当。

【技术实现步骤摘要】
含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种含有多肽的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用。

技术介绍

[0002]冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。现代医疗的发展经历了化学药、生物药，并已向细胞药迈进。然而(离体)体外培养的细胞会经历复制性的衰老和死亡。因此，“细胞”成为货架上即取即用的药物，首先要解决的就是存储问题。作为目前唯一有望实现“细胞”长期存储和远程运输的技术，冷冻保存已成为细胞治疗不可或缺的技术支撑。通常，在细胞冷冻保存过程中，需要添加冷冻保存试剂以使细胞免受冰冻伤害。因此，冷冻保存试剂是决定冷冻保存能否成功的关键物质基础。
[0003]目前最常用的冷冻保存试剂为玻璃化冻存试剂，其中含有大量的强水合作用的小分子如二甲基亚砜(DMSO≥10％)，DMSO的添加可以抑制冷冻保存过程中冰晶的形成(细胞内外的液体均成玻璃化状态而避免冰晶的生成)。然而，DMSO具有细胞毒性，酶毒性等导致冷冻保存试剂对细胞的毒副作用，严重影响冷冻保存对象复苏后的生物安全性甚至功能表达。

技术实现思路

[0004]为改善现有技术的上述缺陷，本专利技术提供含有LEA蛋白保守结构域，以下简称“LEA蛋白功能区的多肽”，和含有该类多肽的冷冻保存液，以及这些多肽和含有该多肽的冷冻保存液的应用，特别是在干细胞冷冻保存中的应用。
[0005]本专利技术通过如下技术方案实现:
[0006]本专利技术提供了一种多肽，其特征在于，包含LEA蛋白功能区的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。优选地，所述多肽是LEA蛋白功能区。
[0007]根据本专利技术，所述多肽选自下述a)至c)中的至少一组：
[0008]a)具有表1中所示的氨基酸序列；
[0009]b)由表1中所示的氨基酸序列的多肽两端缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的且具有a)所述多肽的功能的衍生多肽；或
[0010]c)与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性高于90％。
[0011]根据本专利技术，优选地，所述c)中，所述与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性在90
‑
99％之间，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
[0012]根据本专利技术，优选地，所述多肽的氨基酸序列如表1中所示的多肽。
[0013]根据本专利技术，更优选地，所述多肽的氨基酸序列如表2中所示的多肽。
[0014]本专利技术还提供了一种多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种：
[0015](a)编码具有表1中所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；
[0016](b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；或
[0017](c)与(a)或(b)有至少70％同源性的多核苷酸。
[0018]根据本专利技术，所述c)中，与(a)或(b)的多核苷酸相比，同源性在70
‑
99％之间，例如70％，71％，72％，75％，78％，80％，81％，82％，85％，88％，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。
[0019]根据本专利技术，优选地，所述多核苷酸包含编码具有表1中所示氨基酸序列的多核苷酸。
[0020]根据本专利技术，更优选地，所述多核苷酸编码如表1中所示的多肽。
[0021]根据本专利技术，更优选地，所述多核苷酸编码如表2中所示的多肽。
[0022]本专利技术还提供了上述多肽的制备方法，可以采用本领域已知的多肽合成方法合成，例如采用固相合成法合成。
[0023]本专利技术还提供上述多肽在细胞、组织或器官的冷冻保存中的应用。
[0024]根据本专利技术的应用，所述多肽可以和其他控冰材料组合使用，所述其他控冰材料为氨基酸单体、聚氨基酸、糖类等中的至少一种。
[0025]本专利技术还提供一种冷冻保存液，其含有上述多肽。
[0026]根据本专利技术的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1
‑
50g所述多肽。优选含有0.1
‑
20g所述多肽，还优选0.2
‑
10g所述多肽，更优选含有0.5
‑
8g所述多肽，还更优选含有1
‑
5g所述多肽。
[0027]根据本专利技术的冷冻保存液，还进一步包括氨基酸单体、聚氨基酸、糖类或者DMSO、多元醇中的一种或两种以上。
[0028]根据本专利技术，所述氨基酸单体可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种或两种以上。优选地，所述氨基酸单体为脯氨酸，更优选地，所述氨基酸单体为L
‑
Pro。
[0029]根据本专利技术，所述聚氨基酸可选自赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、组氨酸等中至少一种的均聚物或两种以上氨基酸的共聚物。优选地，所述聚氨基酸为聚脯氨酸8。更优选地，所述聚氨基酸为L
‑
Pro8(即聚合度为8的聚脯氨酸)。
[0030]根据本专利技术，所述多元醇可以为碳原子数为2
‑
6的多元醇，例如碳原子数为2
‑
5的多元醇，优选碳原子数2
‑
3的二元醇、和/或三元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种；优选乙二醇。
[0031]根据本专利技术的冷冻保存液，所述糖类是多羟基醛、多羟基酮以及能水解而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物，可分为单糖、二糖和多糖等。按其水溶解特点不同,可分为非水溶性糖类或水溶性糖类，例如单糖、二糖或多糖。优选地，所述糖类为水溶性糖。更优选地，所述糖类为葡萄糖和蔗糖。
[0032]根据本专利技术，所述水溶性糖类可以为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、水溶性纤维素(例如羟丙基甲基纤维素等)、聚蔗糖；优选蔗糖、葡萄糖、羟丙基甲基纤维素。所述水溶性糖可以起到保护细胞膜和避免细胞沉降的作用。
[0033]根据本专利技术的冷冻保存液，还可以含有缓冲液。
[0034]根据本专利技术，所述缓冲液可选自DPBS或hepes
‑
buffered缓冲液、或其他细胞培养基缓冲液中的至少一种。
[0035]根据本专利技术的冷冻保存液，还可以含有血清。
[0036]根据本专利技术，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其类似物，例如十二烷基磺酸钠(SDS)；针对非人源性冷冻保存对象可选胎牛血清或牛血清白蛋白。
[0037]根据本专利技术的冷冻保存液，以每100mL计，含有0.1
‑
50g所述多肽，0
‑
9.0g的氨基酸或聚氨基酸，0
‑
15mL的DMSO，5.0
‑
45mL的多元醇，0.1
‑
1.0mol L
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液含有多肽。其中，所述多肽是包含LEA蛋白功能区的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。优选地，所述多肽是LEA蛋白功能区。2.如权利要求1所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液含有的多肽选自下述a)至c)中的至少一组：a)具有表1中所示的氨基酸序列；b)由表1中所示的氨基酸序列的多肽两端缺失或添加一个或多个氨基酸而形成的且具有a)所述多肽的功能的衍生多肽；或c)与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性高于90％。优选地，所述c)中，所述与表1中所示的氨基酸序列的多肽相比，同源性在90
‑
99％之间，例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％。优选地，所述多肽的氨基酸序列如表1中所示的多肽。更优选地，所述多肽的氨基酸序列如表2中所示的多肽。3.根据权利要求1或2所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，以每100mL冷冻保存液体积计，含有0.1
‑
50g所述多肽。优选地，所述冷冻保存液含有0.1
‑
20g所述多肽。还优选，所述冷冻保存液含有0.2
‑
10g所述多肽。更优选，所述冷冻保存液含有0.5
‑
8g所述多肽。还更优选，所述冷冻保存液含有1
‑
5g所述多肽。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的冷冻保存液在干细胞冷冻保存中的应用，其特征在于，所述冷冻保存液还含有仿生控冰材料0
‑
50g，多元醇5.0
‑
45mL，水溶性糖0.1
‑
1.0mol L
‑1，血清0
‑
30mL，余量为缓冲液。5.根据权利要求4所述的冷冻保存液在工程细胞和/或细胞系冷冻保存中的应用，其特征在于，所述多元醇为碳原子数为2
‑
5的多元醇，例如乙二醇，丙二醇，丙三醇中的任一种；优选，所述水溶性糖为非还原性双糖、水溶性多糖、糖酐中的至少一种，例如选自蔗糖、葡萄糖、海藻糖、水溶性纤维素、聚蔗糖；优选地，蔗糖、葡萄糖、羟丙基甲基纤维素。优选，所述缓冲液选自DPBS或hepes
‑
buffered HTF缓冲液或其他细胞培养基缓冲液中的至少一种；优选，所述血清针对人源性冷冻保存对象可选人血清白蛋白或其替代物，例...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娜，
申请(专利权)人：君创永晟东莞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：