一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法及其应用技术

本发明专利技术涉及应用微生物学技术领域，具体涉及一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法及其应用，该染色方法将待染色木本植物根内丛枝菌根进行组织切片，使得切片厚度为60μm～100μm，将所得的切片进行染色处理，该染色方法能够高效染色木本植物根内丛枝菌根，使得木本植物根内丛枝菌根染色均匀、图像清晰，便于观察木本植物根内丛枝菌根的细微结构。将上述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法应用在观察木本植物根内丛枝菌根生长状态或测定木本植物根内丛枝菌根侵染率中。或测定木本植物根内丛枝菌根侵染率中。或测定木本植物根内丛枝菌根侵染率中。

【技术实现步骤摘要】
一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法及其应用


[0001]本专利技术涉及应用微生物学
，具体涉及一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法及其应用。

技术介绍

[0002]丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)属于球囊菌门(Glomeromycota)真菌，是一种专性活体营养型共生真菌，能与陆地上超过约80％的植物(约20万种)根系形成一种互惠共生体——丛枝菌根(arbuscular mycorrhizae，AM)。丛枝菌根在土壤中具有分布极为广泛的菌丝网络，促进了植物根系对矿质养分的吸收，如氮和磷，改善了土壤结构，提高了植物的抗胁迫能力，有利于提高作物产量、改善作物品质。因此，AM真菌在农业生产上具有广泛的应用潜力。
[0003]菌根学研究的基础工作是观察菌根生长状态和测定菌根侵染率，几乎所有菌根真菌接种试验均涉及此项工作，因此半个多世纪以来人们非常重视其观察与测定方法的研究，并建立了研究菌根真菌的一系列重要方法。菌根真菌研究通常是对菌根真菌进行染色后再观察其特性，但由于木本植物根系木质化程度高、粗壮且色素较深，不利于对AM真菌细微结构(如丛枝)的显微观察和拍照记录，仅能勉强判断植物是否受到AM真菌的侵染，而无法准确计算出侵染强度(M％)和丛枝丰度(A％)等数据。因此，研究一种能够清晰地观察木本植物根系中AM真菌细微结构的染色方法具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一在于避免现有技术中的不足之处而提供一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，该染色方法能够高效染色木本植物根内丛枝菌根，使得木本植物根内丛枝菌根染色均匀、图像清晰，便于观察木本植物根内丛枝菌根的细微结构。
[0005]本专利技术的目的之二在于提供一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法的应用。
[0006]为实现上述目的之一，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]提供一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，将待染色木本植物根内丛枝菌根进行组织切片，使得切片厚度为60μm～100μm，将所得的切片进行染色处理。
[0008]在一些实施方式中，切片厚度为80μm
[0009]在一些实施方式中，所述组织切片的步骤包括选取长度为0.5cm～2cm的待染色木本植物根内丛枝菌根的根段，用低熔点琼脂糖将其包埋并固定在载玻片上，使用振动切片机Leica VT1000 S进行切片，切片程序为：切片速度0.165mm/s～0.175mm/s，切片频率为40Hz～60Hz。
[0010]在一些实施方式中，所述染色处理的方法为台盼蓝染色法，所述台盼蓝染色法包括以下步骤：
[0011]a)消化：将切片加入6％～10％(W/V)KOH，以80℃～90℃水浴50min～60min，除去
细胞中的细胞质；
[0012]b)酸化：将切片取出冲洗干净后，加入0.15M～0.2M HCl，室温放置4min～5min；
[0013]c)染色：加入0.03％～0.05％(W/V)台盼蓝染液染色，室温染色6min～10min；
[0014]d)脱色：置于脱色液中脱色1d～2d，使非丛枝菌根真菌结构脱色；
[0015]e)观察和拍照记录。
[0016]上述台盼蓝染色法中，无需漂白步骤也能有效地对木本植物根内丛枝菌根进行染色，起到简化实验步骤的作用。
[0017]在一些实施方式中，所述步骤d)中，所述脱色液由乳酸、甘油和蒸馏水混合获得，其中乳酸、甘油和蒸馏水的体积之比为(1～2)：(1～2)：(1～2)。
[0018]在一些实施方式中，所述染色处理的方法为双重荧光染色法，所述双重荧光染色法包括以下步骤：
[0019]a)漂白：将切片置于40％～50％(W/V)的乙醇中孵育1h～3h，漂白根系；
[0020]b)透明：加入15％～20％(W/V)KOH溶液孵育1d～2d，使根系透明；
[0021]c)染色：将切片取出并用pH 7～7.4的PBS缓冲液冲洗干净后，加入0.15ug/ml～0.2ug/ml AlexaWGA 488荧光染料，室温孵育10h～15h，随后加入0.1ug/ml～2ug/ml Sigma
‑
Nile Red荧光染料，抽真空孵育20min～30min；
[0022]d)清洗：用pH 7～7.4的PBS缓冲液震动清洗3次以上，以洗去浮色；
[0023]e)观察和拍照记录。
[0024]本专利技术一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法的有益效果：
[0025](1)本专利技术将木本植物根内丛枝菌根进行切片，克服了木本植物根内丛枝菌根难以染色的问题。切片后的木本植物根内丛枝菌根厚度适宜，极大地增强了染色效果，且由于切片厚度较薄，使得木本植物根内丛枝菌根染色层次均匀、图像清晰、能清楚地观察到木本植物根内丛枝菌根的细微结构，实现了木本植物根内丛枝菌根的高效染色，为菌根研究者提供一种行之有效的染色方法，具有较强的实际应用价值和科研理论价值。
[0026](2)本专利技术的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法方便、快捷，适合于大规模应用。
[0027]为实现上述目的之二，本专利技术提供以下技术方案：
[0028]提供一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法的应用，采用上述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，将其应用在观察木本植物根内丛枝菌根生长状态或测定木本植物根内丛枝菌根侵染率中。
[0029]本专利技术的一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法的应用能清晰地观察到菌根的细微结构，为菌根学研究提供了基础。
附图说明
[0030]图1是使用传统台盼蓝染色法对枳壳菌根的染色情况，标尺从左至右依次为200μm、100μm和50μm。
[0031]图2是实施例1的台盼蓝染色法对枳壳菌根的染色情况，标尺从左至右依次为200μm、100μm和50μm。
[0032]图3是使用传统双重荧光染色法对枳壳菌根的染色情况，标尺从上至下依次为50μ
m、20μm和10μm，从左至右的视图依次为WGA
‑
488染色图、Nile Red染色图、双染合成图。
[0033]图4是实施例4的双重荧光染色法对枳壳菌根的染色情况，标尺从上至下依次为50μm、20μm和10μm，从左至右的视图依次为WGA
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488染色图、Nile Red染色图、双染合成图。
[0034]附图标记
[0035]Ad—正在发育的丛枝；Am—成熟的丛枝；As—衰老的丛枝；A—丛枝；H—菌丝；V—泡囊；NL—中性脂。
具体实施方式
[0036]以下结合具体实施例和附图来进一步说明本专利技术，为便于说明本专利技术的染色方法的功效，实施例选用AM真菌的模式菌种—根内根孢囊霉(Rhizophagus irregularis DAOM 197198)为菌剂，以具有代表性的木本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：将待染色木本植物根内丛枝菌根进行组织切片，使得切片厚度为60μm～100μm，将所得的切片进行染色处理。2.根据权利要求1所述的一种木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：最佳切片厚度为80μm。3.根据权利要求1所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述组织切片的步骤包括选取长度为0.5cm～2cm左右的受丛枝菌根真菌侵染的木本植物根段，用低熔点琼脂糖将其包埋并固定在载玻片上，使用振动切片机Leica VT1000 S进行切片，切片程序为：切片速度0.165mm/s～0.175mm/s，切片频率为40Hz～60Hz。4.根据权利要求1所述的木本植物根内丛枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述染色处理的方法为台盼蓝染色法，所述台盼蓝染色法包括以下步骤：a)消化：将切片加入6％～10％(W/V)KOH，以80℃～90℃水浴50min～60min，除去细胞中的细胞质；b)酸化：将切片取出冲洗干净后，加入0.15M～0.2M HCl，室温放置4min～5min；c)染色：加入0.03％～0.05％(W/V)台盼蓝染液染色，室温染色6min～10min；d)脱色：置于脱色液中脱色1d～2d，使非丛枝菌根真菌结构脱色；e)观察和拍照记录。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚青，尹喜龙，朱红惠，张微，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：