一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用，通过RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备，将双链DNA oligo与线性化的载体相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞进行阳性克隆，构建短发夹RNA慢病毒载体，敲低TSCC内源性PXYLP1基因的表达，抑制了TSCC细胞的增殖能力，诱导了TSCC细胞的凋亡，从而抑制体内肿瘤生长。从而抑制体内肿瘤生长。从而抑制体内肿瘤生长。

【技术实现步骤摘要】
一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及癌症治疗领域，具体涉及短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法及其应用。

技术介绍

[0002]舌鳞状细胞癌(TSCC)是常见的恶性肿瘤之一,具有高死亡率与发病率。它的发展是一个涉及遗传改变和表观遗传修饰的多步骤过程。TSCC是许多变量的致病因素，多种遗传改变和环境因素的积累，如烟草使用，饮酒，慢性炎症和人乳头瘤病毒(HPV)感染等，最近一些报道表明年轻成人的TSCC在发病率增加，特别是在女性中，远处转移率较高，预后较差。因此，由不同风险因素引起的TSCC可能具有不同的分子基础，涉及细胞周期控制和衰老控制的丧失，细胞凋亡的失调，以及口腔扁平苔藓和白班的发生等方面。
[0003]目前化合物或天然提取物质在舌鳞状细胞癌的治疗中应用比较广泛，例如CN 110680815 A和CN 111773218 A，但是小干扰RNA生物药物在制备治疗舌鳞状细胞癌方面的应用较少，化疗药物副作用大，选择性差，靶向性较低，应用有局限性。
[0004]评价肿瘤生物学行为的主要指标有肿瘤细胞增殖、生长形成能力、凋亡等。本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，观察其对肿瘤细胞生物学行为的影响，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。

技术实现思路

[0005]针对上述存在的技术不足，本专利技术的目的是提供一种短发夹RNA介导敲低舌鳞癌细胞PXYLP1的方法，通过通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，以实现抑制肿瘤的作用。
[0006]为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：
[0008]SEQ 1：
[0009]5’‑
CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG
‑3’
[0010]SEQ 2：
[0011]5’‑
AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG
‑3’
。
[0012]优选地，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，所述慢病毒载体由上述合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供所述的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
[0015]1)针对RNA干扰靶点序列设计合成双链DNA oligo：合成权利要求1所述的DNA oligo的正链和反链，将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min；自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链DNA；
[0016]2)线性化载体的制备：使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体使其线性化，37℃反应1h，切胶回收目的片段；
[0017]3)生成双链DNA oligo与线性化载体的连接产物：将步骤1)得到的双链DNA oligo与步骤2)得到的线性化载体于20μl反应体系中，16℃反应1h
‑
3h，连接产物命名为psc54972；
[0018]4)克隆转化：将步骤3)连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行PCR鉴定；
[0019]5)质粒抽提：将测序正确的菌液转接于培养基中，提取质粒，将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。
[0020]本专利技术的第四个目的是提供所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
[0021]本专利技术的第四个目的是提供一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体在制备舌鳞癌诊断、治疗和预后预测药物中的应用。
[0022]本专利技术的有益效果在于：本研究通过敲低舌鳞癌细胞系内源性PXYLP1基因的表达，包括针对PXYLP1基因的干扰靶点序列，包装构建慢病毒，对PXYLP1基因进行敲减后，发现显著影响舌鳞癌细胞CAL
‑
27细胞和SCC
‑
25细胞的增殖，影响细胞生长形成能力，并促进细胞的凋亡，并通过体内实验进行了验证，表明该基因可能调控肿瘤的发生发展，可能成为舌鳞癌的一个潜在治疗靶点，为舌鳞癌患者的预后判断以及手术和靶向治疗方案提供参考。探索无创、安全和便捷的方式检测特异性基因PXYLP1，有利于辅助舌鳞癌诊断、治疗和预后预测。
附图说明
[0023]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]图1为为线粒化载体的琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道1：1kb Marker：从上至下依次为10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3.5kb，3kb，2.5kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp；泳道2：Age I和EcoR I双酶切线性化后的载体质粒；泳道3：没有酶切的载体质粒；
[0025]图2为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图；
[0026]图3为琼脂糖凝胶电泳检测条带；其中泳道1：阴性对照(ddH2O)，排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果；泳道2：自连对照(空载体自连对照组)；泳道3：250bp Marker：从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp；泳道4
‑
8：单克隆psc54972
‑
1,2,3,4,5；
[0027]图4为PXYLP1在癌组织和癌旁组织中的表达差异图；
[0028]图5为PXYLP1在SCC
‑
25细胞和CAL
‑
27细胞中mRNA的表达丰度；
[0029]图6为CAL
‑
27细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0030]图7为SCC
‑
25细胞被成功地感染了表达PXYLP1 shRNA或对照shRNA psc3741的慢病毒；
[0031]图8为mRNA水平PXYLP1基因消减效率示意本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括DNA oligo的正链和反链，所述正链为序列表SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反链为序列表SEQ ID NO.2所示的碱基序列，所述的正链和反链退火，形成带粘性末端的双链DNA：SEQ 1：5
’‑
CCGGCCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGGTTTTTG
‑3’
SEQ 2：5
’‑
AATTCAAAAACCCGGTAAGAAACCAGTATCTCTCGAGAGATACTGGTTTCTTACCGGG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA干扰靶点为CGGTAAGAAACCAGTATCT。3.一种权利要求1所述的敲低PXYLP1基因表达的shRNA的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体由权利要求1合成的双链DNA克隆入慢病毒载体GV 115中制成。4.一种权利要求3所述的慢病毒载体的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟箭，周霖，李欣然，顾徐嘉，陈霖，
申请(专利权)人：徐州市中心医院，
类型：发明
国别省市：