本发明专利技术公开一种烟草镉转运基因NtNRAMP6A及其应用。所述烟草NtNRAMP6A具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列，其编码蛋白质具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明专利技术克隆得到NtNRAMP6A基因，通过镉敏感酵母转化及烟草基因编辑证明NtNRAMP6A基因具有镉转运功能，可用于降低烟草对镉元素的富集。用于降低烟草对镉元素的富集。用于降低烟草对镉元素的富集。
【技术实现步骤摘要】
一种烟草镉转运基因NtNRAMP6A及其应用
[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体来说，涉及烟草镉转运相关NtNRAMP6A基因及其应用。
技术介绍
[0002]烟草具有较强的镉富集能力，烟草植株吸收过多的镉会增加烟气中的镉浓度而危害吸烟人群健康。此外，镉做为植物生长非必需元素之一，土壤中较高浓度的镉会影响烟草根系生长、叶绿体形成，进而影响其生物学产量和品质。植物中镉的积累涉及到镉的吸收、转运、分配等诸多过程，其调控网络及分子机制仍待进一步解析。
[0003]目前，烟草中发现的镉转运基因较匮乏，已报道的主要有NtHMA2/4，NtNRAMP5等少数几个。植物NRAMP基因家族功能较为复杂，有广泛的底物特异性，且具有铁、锰、锌等多种金属的转运活性，维持植物体内金属离子的平衡。此外，该基因家族在光合作用、蛋白质活性维持、代谢和环境应激反应等方面也起到重要的调控作用。烟草属于异源四倍体植物，基因家族成员众多，发掘和鉴定新的烟草镉转运相关NRAMP基因，进而通过基因编辑等手段获得低镉富集新品种，对保障烟叶安全性具有重要意义。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供烟草NtNRAMP6A基因及其编码的蛋白质。
[0005]本专利技术的另一目的是提供烟草NtNRAMP6A基因的应用。
[0006]本专利技术烟草NtNRAMP6A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，基因全长1602bp。
[0007]本专利技术提供的烟草NtNRAMP6A基因，其为编码如下蛋白质(a)的基因：
[0008](a)由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0009]本专利技术提供所述烟草NtNRAMP6A基因或突变该基因在降低植物镉离子富集中的应用。
[0010]本专利技术还提供所述烟草NtNRAMP6A基因或突变该基因在烟草育种中的应用。所述育种的目的为降低烟草镉离子吸收和转运。
[0011]优选地，将所述烟草NtNRAMP6A基因进行突变，使烟草NtNRAMP6A基因产生突变以降低烟草植株对镉的富集能力，或通过杂交等方式获得携带NtNRAMP6A基因突变的材料。
[0012]本专利技术还提供用于扩增烟草NtNRAMP6A基因的特异性PCR引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:3和4所示。
[0013]本专利技术还提供一种降低植物镉离子吸收和转运的方法，所述方法为：
[0014]使烟草NtNRAMP6A基因发生突变，所述方法包括但不限于基因编辑、诱变、杂交。
[0015]本专利技术首次从烟草中克隆得到烟草NtNRAMP6A，并通过酵母实验和基因编辑验证了该基因的生物学功能。将NtNRAMP6A基因转入镉敏感酵母突变株Δycf后的重组酵母具有镉敏感特性，编辑纯合植株的叶片镉含量降低。因此，本专利技术提供的烟草NtNRAMP6A基因具有镉转运的功能。
附图说明
[0016]图1为本专利技术实施例1中酵母功能互补实验结果。其中，A：培养基中镉离子浓度为0μM，B：培养基中镉离子浓度为20μM。图中，Δycf+Pyes2为阴性对照组(转入空载体)，Δycf+NtNRAMP6A为转入烟草NtNRAMP6A基因的重组酵母；从左到右依次为10倍稀释液、100倍、1000倍、10000倍稀释液在培养基上的生长结果。
具体实施方式
[0017]实施案例1：烟草NtNRAMP6A基因克隆
[0018]烟草K326播种后，温室培养至5～6片真叶时，取新鲜叶片使用Axygen公司的植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，使用TaKaRa公司反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。
[0019]以Genbank数据库中的NRAMP基因(登录号:XM_016625392.1)为参考序列，使用Primer 5设计正向引物和反向引物。所述的正向引物核苷酸序列为SEQ NO:3：5
’‑
ATGGCGGCGAACTCGACCCCA
‑3’
，所述反向引物核苷酸序列为SEQ NO:4：5
’‑
TCAATTAGTGGTCCTCTGCTGA
‑3’
。
[0020]以烟草
‘
K326
’
的cDNA模板，使用NEB公司的KOD Fx NEO高保真酶进行烟草NRAMP6A基因扩增。反应体系为50μl：2
×
PCR Buffer 25μL，dNTPs 10μL，KOD Fx NEO 1μL，正向引物2μL，反向引物2μL，烟草cDNA 2μL，dd H2O 8μL；
[0021]扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s；60℃退火30s；68℃延伸30s；35个循环；72℃延伸15min；4℃保温。
[0022]利用胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收后，连入pGEM
‑
T载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，接种于加有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养获得阳性克隆。采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆，菌落PCR的正向引物为SEQ NO:5：5
’‑
ACTGATTTACAAGCTGGAGCTC
‑3’
，反向引物为SEQ NO:6：5
’‑
AGAACTTCTGAAGACTCCGGCT
‑3’
。
[0023]菌落PCR的反应体系为20μL，包括Premix Ex Taq10μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dd H2O 7μL，菌液1μL。然后从已验证的阳性克隆中随机选取3个独立的阳性克隆送到生物公司进行测序，经测序得到烟草NRAMP6A基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
[0024]实施案例2镉敏感酵母的转化及表型测定
[0025]1.酵母感受态制备
[0026]1)酵母菌株为Δycf1(MATa；his3Δl；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0；YDRl35c::kan MX4)的镉敏感性菌株。挑酵母菌株(Δycf)在YPDA固体培养基上划板，30℃倒置培养，待菌生长至适宜大小。挑单菌落接种于含有3mL YPDA液体培养基的离心管中，30℃，250rpm摇菌8
–
12小时。吸取5μL菌液转入含有50mL YPDA液体培养基的250mL三角瓶中。30℃，250rpm继续摇16
–
20小时，期间测OD值，OD600达到0.15
–
0.3的时候停止摇菌。
[0027]2)室温下，700g离心5min收集菌体，弃上清，加入100mL YPDA液体培养基重悬菌体。30℃，250rpm摇3
–
5小时至OD600为0.4
–
0.5。取50mL菌液，700g离心5min收集菌体。加入30mL无菌超纯水，重悬菌体。700g离心5min收集菌体。弃上清，加入1.5mL 1.1xTE/LiAc重悬菌体。...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.NRAMP6A基因在降低植物镉离子吸收和转运中的应用，所述的NRAMP6A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.NRAMP6A基因在制备转基因植物中的应用，所述的NRAMP6A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.NRAMP6A在植物育种中的应用，所述的NRAMP6A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求2所述的应用，所述的育种的目的是降低植物镉离子吸...
【专利技术属性】
技术研发人员：张吉顺，张孝廉，付强，王志红，孔德钧，林英超，陈懿，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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