一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用。该SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，敲除后的番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖含量显著增加，苹果酸和柠檬酸含量显著降低。苹果酸和柠檬酸含量显著降低。

【技术实现步骤摘要】
一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及在培育高糖含量番茄中的应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及其在培育高糖含量番茄中的应用。

技术介绍

[0002]果蔬作为膳食平衡的重要组成部分，富含多种有益人类健康的营养物质，包括糖类，维生素，矿物质和抗氧化物等。果蔬的品质与其经济价值密切相关，主要包括外观、口感、风味、营养成分以及质地等方面，因此致力于果蔬品质改良的研究具有重要的应用价值。
[0003]糖类化合物是重要的能量源物质，是一切生物体维持生命活动所需热能的主要来源，膳食中糖类供给的能量约占人体总需热能的60％
‑
70％。糖类化合物是影响果蔬风味以及营养价值的主要因素，是衡量果蔬品质和经济价值的重要指标之一。
[0004]番茄是重要的经济作物，因其果实肉质鲜美、营养丰富、风味独特而深受消费者青睐，作为鲜食果蔬在世界范围内广泛栽种。番茄果实的品质主要分为外观品质和内在风味两个方面。外观品质包括果形、大小、颜色等，而内在风味主要由果实的甜度、酸度、果肉硬度和果汁含量决定。糖分及有机酸类组分的含量与番茄果实的风味品质密切相关，适宜的糖酸比值，造就了番茄果实独特的风味。对于番茄育种者而言，提升番茄果实风味的关键在于如何増加果实口感上的甜味。目前，传统育种方法耗时长且效果不稳定，往往存在很大的盲目性和不可预测性。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因及其在培育高糖含量番茄中的应用，通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，获得了高糖含量的番茄果实，果实的风味显著提高，极大地提升了番茄果实品质和经济价值。
[0006]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007]一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因，该SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]进一步地，SlGRAS9基因还可以是与如SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
[0009]上述SlGRAS9基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]一种CRISPR/cas9碱基编辑器，其包括载体以及可识别SlGRAS9基因靶序列的sgRNA。
[0011]进一步地，载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]一种重组农杆菌，包括上述CRISPR/cas9碱基编辑器。
[0013]一种提升番茄果实糖含量的制剂，制剂包括可以抑制SlGRAS9基因的活性成分。
[0014]上述SlGRAS9基因、碱基编辑器或重组农杆菌在提升番茄果实糖含量中的应用。
[0015]上述SlGRAS9基因、碱基编辑器或重组农杆菌在培育果实高糖含量番茄品种或番茄种质资源改良中的应用。
[0016]本专利技术的有益效果：
[0017]本专利技术通过CRISPR/cas9基因编辑技术，将番茄的内源基因SlGRAS9在番茄中敲除，敲除后的番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖含量显著增加，苹果酸和柠檬酸含量显著降低。此外，本专利技术采用CRISPR/cas9基因编辑技术，高效并可稳定遗传地提高了番茄果实中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，极大地增强了番茄果实口感上的甜味，从而提高果实品质。为番茄种质资源创新提供基因资源和策略，旨在更好的满足消费者的需求。
附图说明
[0018]图1为构建的Cas9/pORE CRISPR/cas9表达载体；
[0019]图2为SlGRAS9基因CRISPR/cas9基因敲除植株阳性鉴定结果；
[0020]图3为SlGRAS9基因敲除株系编辑情况；
[0021]图4为野生型番茄与SlGRAS9基因敲除株系番茄红熟期果实中蔗糖、果糖、葡萄糖、苹果酸和柠檬酸含量的检测结果；
[0022]图5为野生型番茄与SlGRAS9基因敲除株系番茄红熟期果实中可溶性固形物含量、酸度及糖酸比检测结果。
具体实施方式
[0023]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0024]实施例1构建SlGRAS9基因CRISPR/cas9基因敲除系统
[0025]1、设计SlGRAS9基因的靶序列
[0026]利用http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp网站进行靶位点设计。在靶点设计的结果中可评估所有候选靶点的序列、位置、GC含量、潜在的脱靶位等点等相关信息，选择GC含量在45％～70％范围内，位置在基因CDS的前2/3区域(ATG之后，但不要在最后一个外显子上)，与基因组中其他任意位置至少有三个碱基不匹配的的靶点。
[0027]2、构建SlGRAS9基因的sgRNA表达盒
[0028](1)利用Overlapping PCR法获得SlGRAS9基因sgRNA表达盒。首先进行第一轮PCR，以gRNA表达载体U26为模板，使用PrimerSTAR高保真酶和利用引物对1：U26
‑
HindIII
‑
F：和U26
‑
target
‑
R1：(下划线部分为载体接头序列)以及引物对2：U26
‑
target
‑
F2：
和U26
‑
NheI
‑
R：(下划线部分为载体接头序列)进行PCR扩增将靶点序列引入到U6
‑
26启动子下游和sgRNA序列的上游，其扩增体系如表1所示。
[0029]表1第一轮PCR扩增体系
[0030][0031]其扩增程序为：98℃预变性1min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。
[0032](2)然后进行第二轮PCR，以第一轮的两个PCR产物为模板，利用U26
‑
HindIII
‑
F和U26
‑
target
‑
R1扩增得到包含启动子、靶点和sgRNA的完整的sgRNA表达盒。
[0033]第二轮PCR以第一轮的两个PCR产物为模板，使用PrimerSTAR高保真酶和U26
‑
HindIII
‑
F和U26
‑
target
‑
R1扩增引物进行PCR扩增，反应体系如表2所示：
[0034]表2第二轮PCR扩增体系
[0035][0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因，其特征在于，所述SlGRAS9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的调控番茄果实糖含量的SlGRAS9基因，其特征在于，所述SlGRAS9基因还可以是与如SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上同源性，且编码相同功能蛋白的核苷酸序列。3.权利要求1所述的SlGRAS9基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.一种碱基编辑器，其特征在于，所述碱基编辑器包括载体以及可识别SlGRAS9基因靶序列的sgRNA。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李正国，时源，刘豫东，梁琴，成玉林，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：