载体制造技术

本发明专利技术涉及适用于体内递送治疗基因的重组病毒载体领域。描述了一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含(i)人生长激素内含子3(hGHi3)序列，(ii)突触蛋白启动子序列和/或(iii)颗粒蛋白前体3'非翻译区(UTR)序列，其与编码感兴趣的多肽的多核苷酸序列有效连接。此类载体的具体用途在于增强感兴趣的多肽如颗粒蛋白前体(PGRN)的表达，以治疗具有基因突变或低于生理上正常水平的内在多肽水平的受试者。上正常水平的内在多肽水平的受试者。上正常水平的内在多肽水平的受试者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】载体
专利

[0001]本专利技术涉及重组病毒载体领域。具体地，本专利技术涉及适用于体内递送治疗基因的重组病毒载体。
[0002]专利技术背景
[0003]额颞叶痴呆(frontotemporal dementia，FTD)是表现出症状的小于65岁的人群中第二常见的痴呆形式。它的特征在于行为、性格和语言的变化，并且对患者、他们的家人和朋友来说非常痛苦。约30％的FTD患者具有痴呆的家族史，其中约20％携带编码蛋白颗粒蛋白前体(progranulin)的GRN基因的功能丧失(loss of function，LoF)突变。GRN突变纯合的儿童会发展为溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder)神经元蜡样质脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinosis，NCL11)，其特征在于神经退行性和失明(Rohrer JD等人,(2015b)Lancet Neurol.14:253
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262)。LOF突变杂合的成人会发展为成年发病的FTD，伴有额叶和颞叶皮质神经元中的溶酶体贮积病变(lysosomal storage lesion)和TDP
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43包涵体(inclusion)。症状前GRN突变携带者的MRI扫描显示了在预期的临床发作前约15年的颞叶和顶叶中的结构差异(Rohrer等人，如上所述)。
[0004]目前没有有效的显著改变任何形式的FTD、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)或任何形式的神经退行性疾病的疾病进展的治疗方法。为FTD开具的唯一药物被设计为减轻抑郁症(抗抑郁药)或问题行为(强镇静剂(major tranquiliser))的影响，并且这些通常具有显著有害的短期和长期副作用。
[0005]颗粒蛋白前体(PGRN)是一种分泌型糖蛋白，其对神经元具有重要的营养作用、抑制炎症并在自噬中起关键作用(Chitramuthu BP等人,(2017)Brain.140(12):3081
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3104)。颗粒蛋白前体由小神经胶质细胞和神经元产生，但被所有的细胞类型摄取(take up)。一旦它与其细胞膜上的受体分拣蛋白(sortilin)结合，它就会被内体(endosome)导入并递送至溶酶体，在那里它被降解成多个颗粒蛋白(Holler CJ等人,(2017)eNeuro.18:4)。这些颗粒蛋白的一者充当蛋白酶组织蛋白酶D(cathepsin D)的伴侣蛋白(chaperone)，以促进溶酶体酸化和有效的蛋白水解。溶酶体缺陷抑制自噬，并且TDP
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43在核和细胞质包涵体中积累。
[0006]GRN
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小鼠表现出不易察觉的行为表型(社会优势降低)，并且尽管发展了脂褐质沉积症、反应性神经胶质增生(reactive gliosis)和异常溶酶体，但它们不会发展TDP
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43蛋白病(TDP
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43proteinopathy)或神经元丧失(Arrant AW等人,(2018)J.Neurosci.38(9):2341
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2358)。从小鼠神经元中选择性敲除GRN(Petkau TL等人,(2017)Neurobiol Dis.106:14
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22)或从小神经胶质细胞中部分敲除(Petkau TL等人,(2017)J.Neuroinflammation.14(1):225)使PGRN水平降低了约50％，但不会导致表型或可检测的病理学。这表明这两种细胞类型均能够分泌足够的颗粒蛋白前体以递送组织广度的交叉校正(cross
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correction)。
[0007]尽管不存在好的动物模型，但使用病毒载体递送PGRN的先前研究已显示出前景。由腺相关病毒1(AAV1)递送的小鼠GRN基因向12个月龄GRN
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小鼠的实质内(intraparenchymal)输注可减少脂褐质沉积症和炎症，表明了补充颗粒蛋白前体可以逆转病理方面(Arrant AE等人,(2017)Brain.140(5):1447
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1465；Arrant AE等人,(2018)如上
所述)。然而，另一项使用由AAV9和AAV4递送的高约33倍剂量的人类GRN的研究报告了3个月后显著的海马体退行和T细胞在GRN
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小鼠和非转基因小鼠中的浸润(Amado DA等人,doi:https://doi.org/10.1101/308692)。
[0008]最近一项AAV9
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SMN在1型脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)中的试验的显著成功刺激了对神经病症的基因治疗的研究。SMA由存活运动神经元基因(survival motor neuron gene，SMN)的纯合缺失引起。这些儿童生来就软弱无力(floppy)，并且逐渐变得更虚弱，以至于他们从不坐下、爬行、站立或说话，因为95％的孩子在两岁之前就已经被供氧。在1至7个月龄间被给予单次注射AAV9
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SMN的15名患者中，没有人需要供氧，并且14/15的肌肉力量显著增加，以至于他们可以无需帮助即可站立和行走并且所有人都能够说话(Mendell JR等人,(2017)N.Engl.J.Med.377(18):1713
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1722)。
[0009]然而，据报道，非人类灵长类动物和小型猪中的高剂量静脉内AAV9
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SMN具有毒性(Hinderer C等人,(2018)Hum.Gene Ther.29:285
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298)，因此应仔细考虑在任何临床试验中使载体剂量最小化。此外，AAV载体生产是一个极其昂贵的过程，目前估计每位患者高达～100万美元。
[0010]因为GRN过表达可以使表达TDP
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43突变形式(其模拟肌萎缩侧索硬化症(ALS)和FTD)的转基因小鼠的存活加倍(Beel S等人,(2018)Mol.Neurodegener.13(1):55)，归因于与GRN突变无关的TDP
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43积累，AAV
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GRN治疗可以是针对ALS和FTD的成功治疗。通过向阿尔茨海默病转基因小鼠模型施用慢病毒递送的GRN还增强了脑中淀粉样蛋白β沉积的清除(Minami SS等人,(2014)Nat.Med.20(10):1157
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64)，并且颗粒蛋白前体基因递送已在帕金森病的MTPT毒素模型中显示出具有神经保护作用(Van Kampen JM等人,(2014)PLoS One.9(5):e97032)。由于GRN能够增强自噬并减少炎症，AAV
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GRN还可以为许多其他其中积累了错误折叠蛋白的神经退行性病症提供治疗益处。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含核酸，所述核酸包含(i)人生长激素内含子3(hGHi3)序列，(ii)突触蛋白启动子序列，和/或(iii)颗粒蛋白前体3'非翻译区(UTR)序列，其与编码感兴趣的多肽的多核苷酸序列有效连接。2.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包含编码颗粒蛋白前体的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与SEQ ID NO:4具有至少95％的序列同一性。3.如权利要求1或权利要求2所述的AAV载体，其包含hGHi3序列。4.如权利要求3所述的AAV载体，其中所述hGHi3序列包含SEQ ID NO:7的序列或其变体或同源物。5.如任一项前述权利要求所述的AAV载体，其中所述感兴趣的多肽是颗粒蛋白前体(PGRN)，优选包含SEQ ID NO:16的序列或其变体或同源物。6.如权利要求1至5中任一项所述的AAV载体，其中所述多核苷酸序列经密码子优化。7.如权利要求6所述的AAV载体，其中所述多核苷酸序列针对在人类中表达而进行密码子优化。8.如权利要求1至7中任一项所述的AAV载体，其中所述核酸进一步包含外显子剪接元件(ESE)。9.如权利要求8所述的AAV载体，其中所述ESE位于所述多核苷酸编码序列的上游。10.如权利要求9所述的AAV载体，其中所述ESE是5'侧翼序列的一部分或插入5'侧翼序列中。11.如权利要求8至10中任一项所述的AAV载体，其中所述ESE是引导序列的一部分或插入引导序列中。12.如从属于权利要求6时的权利要求8至11中任一项所述的AAV载体，其中所述ESE是衍生自野生型多核苷酸序列的5'侧翼序列的一部分。13.如权利要求10至12中任一项所述的AAV载体，其中所述5'侧翼序列是衍生自野生型GRN的5'引导序列。14.如权利要求13所述的AAV载体，其中野生型GRN 5'引导序列包含350至450个碱基对。15.如任一项前述权利要求所述的AAV载体，其包含颗粒蛋白前体3'非翻译区(UTR)序列，优选地，其中所述3'UTR序列包含SEQ ID NO:14的序列或其变体或同源物。16.如权利要求1
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15中任一项所述的AAV载体，其中所述多核苷酸序列包含衍生自hGH的信号序列。17.如权利要求16所述的AAV载体，其中所述hGH信号序列包含SEQ ID NO:9的序列或其变体或同源物。18.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：伦敦王室学院，
类型：发明
国别省市：