一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述探针引物是由SEQ ID NO：22

【技术实现步骤摘要】
一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途


[0001]本专利技术属于医药
，涉及药物鉴别检测方法，尤其涉及一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。

技术介绍

[0002]贝母类药材是常用大宗药材，具有止咳化痰功效，其中川贝母、伊犁贝母和平贝母均收录于《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)，传统认为川贝母效果最佳，且以野生为主，价格在各种贝母药材中居首位；而伊犁贝母和平贝母为种植品,产量较大,价格较低。《中国药典》川贝母的基原来源收录了百合科植物的6个物种,即川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母F.przewalskii Maxim.、梭砂贝母F.delavayi Franch.、太白贝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen，按性状差异又可分为松贝、青贝、炉贝及栽培品。
[0003]川贝母市场需求量较大，但野生资源有限，伪品屡见不鲜。常见伪品来源主要有伊犁贝母和平贝母等。川贝母掺伪现象严重扰乱了公平竞争的市场秩序，影响着用药的安全性和有效性，最终侵害了消费者的经济和健康利益。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种探针引物及其用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法和用途。所述检测方法能够有效检出伊犁贝母，专属性强，灵敏度高，可用于药材及饮片或成方制剂中是否混有伊犁贝母的定性或定量检测，具有重要的实用价值和应用前景。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种探针引物。所述探针引物其由SEQ ID NO：22
‑
27所示的DNA序列组成。
[0006]另一方面，本专利技术提供了一种用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法。所述方法包括下述步骤：
[0007]称取贝母样品及样品前处理；
[0008]从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及
[0009]选择探针引物；
[0010]优化反应条件；
[0011]根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的CT值临界点(如CT<35)判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(P)和内参探针(C)；供试品中目的探针(P)和内参探针(C)的定量检测比值可表示为
△
CT(T)，相应的标准品可表示为
△
CT(S)，
△△
CT＝
△
CT(T)
‑△
CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母)所占比例计算公式可表示为：供试品(T)/
标准品(S)％＝2
‑△△
CT绝对值
×
100％；
[0012]其中，所述方法能够用于检测所述样品中是否含有伊犁贝母；所述探针引物为序列号为SEQ ID NO22
‑
27的探针引物。
[0013]在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
[0014]在一些实施方式中，所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
[0015]在一些实施方式中，所述提取DNA的步骤采用紫外分光光度法进行定量和纯度测定。
[0016]在一些实施方式中，所述反应条件包括：94℃预变性5min,94℃变性30s，60℃退火30～60s，60℃收集荧光。根据所选反应预混液性质的不同，反应条件可进行调整。
[0017]另一方面，本专利技术提供了所述探针引物的用途，其中，所述探针引物为序列号为SEQ ID NO：和/或所示的探针引物；所述探针引物通过荧光定量PCR检测方法实现伊犁贝母专属性检测。
[0018]在一些实施方式中，每组探针引物包括三个序列，并且当任何一组用于检测时其中所包括的三个序列是同时使用而不拆分。
[0019]在一些实施方式中，检测的所述样品为中药材、饮片或成方制剂。
[0020]另一方面，本专利技术提供了一种试剂盒。所述试剂盒含有上述探针引物，并且所述试剂盒用于伊犁贝母专属性检测。
附图说明
[0021]图1为探针引物的专属性测试。只有在检测伊犁贝母时出现阳性扩增，其他贝母未检出；
[0022]图2为方法检出限测试，从1
‑
5DNA浓度分别为100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng；DNA浓度在0.01ng时仍能检出，表明方法具有较高的灵敏度；
[0023]图3为伊犁贝母掺伪检出限测试，两组曲线分别为100％伊犁贝母和0.1％伊犁贝母掺伪样品的检测情况，1和2分别为总贝母探针引物和伊犁贝母专属性探针引物。
具体实施方式
[0024]下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细的描述，这些实施例仅仅是说明性的，因此不应将其解释为对本专利技术范围的限制。
[0025]一、仪器与试剂
[0026]实时荧光定量PCR仪(AB 7500FAST)，分析天平(Mettler AB135
‑
S)，纯水仪(Millipore公司)，球磨仪(M400，Retsch)，微量紫外分光光度计，高速离心机，金属加热器。植物基因组提取试剂盒(DP321，天根生化科技有限公司)，Universal Master Mix II。
[0027]二、样品收集
[0028]收集准确来源的川贝母6个基原样品、平贝母、伊犁贝母及其他常见药用贝母、市售样品共计100余批。具体信息见附件1样品信息表。
[0029]三、样品处理与DNA提取
[0030]1.样品处理及DNA提取
[0031]将供试品研成极细粉，精密称定20mg，使用植物基因组提取试剂盒提取DNA，得到供试品溶液。伊犁贝母对照药材制成极细粉，精密称定20mg，同法制成阳性对照溶液。如为成方制剂，可酌情加大取样量在50～200mg。
[0032]2.DNA提取具体步骤：
[0033]加入400μl缓冲液FP1和6μl的RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min。加入130μl缓冲液FP2，充分混匀，涡旋振荡1min。12,000rpm(～13,400
×
g)离心5min，将上清转移至新的离心管中；重复上述步骤。向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，(例如500μl的上清液加350μl异丙醇)，充分颠倒混匀，12,000rpm(～13,400
×
g)离心本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种探针引物，其特征在于，所述探针引物是由SEQ ID NO：22
‑
27所示的DNA序列组成。2.一种用于伊犁贝母专属性检测的荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括下述步骤：称取贝母样品及样品前处理；从所述样品中提取DNA并制备DNA模板；及选择探针引物；优化反应条件；根据不同的检测需求，设定不同的判定依据。根据不同的检测需求，设定不同的判定依据；其中对于定性检测，根据设定的CT值临界点(如CT<35)判定是否检出；对于半定量检测，根据与阳性对照的CT值之差的绝对值作为判定依据，差值越小，含量越高；对于定量检测，一方面同时设置标准品(S)，另一方面采用同体系中双探针标记进行扩增，即包括目的探针(P)和内参探针(C)；供试品中专属探针(P)和通用探针(C)的定量检测比值可表示为
△
CT(T)，相应的标准品可表示为
△
CT(S)，
△△
CT＝
△
CT(T)
‑△
CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母)所占比例计算公式可表示为：CT(S)从而目的DNA(伊犁贝母)所占比例计算公式可表示为：其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文娟，魏锋，马双成，张南平，李明华，于健东，姚令文，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：