融合蛋白及其表达细胞株与应用制造技术

本发明专利技术涉及生物免疫治疗技术领域，尤其涉及融合蛋白及其表达细胞株与应用。本发明专利技术通过基因工程改造将融合蛋白(IL

【技术实现步骤摘要】
融合蛋白及其表达细胞株与应用


[0001]本专利技术涉及生物免疫治疗
，尤其涉及融合蛋白及其表达细胞株与应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤(NK)细胞通过杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)及共刺激受体依赖、主要组织相容性复合物(MHC)非依赖方式识别病变细胞，不需提前免疫致敏，可在几十分钟内杀伤恶性细胞，因而被认为是最有效的体内监视和清除病变细胞的免疫细胞亚群，在机体早期抗病毒的免疫应答中同样起到关键作用。在恶性血液性疾病如急性髓系白血病及肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、黑色素瘤等多种实体瘤中有着巨大的前景。
[0003]NK细胞具有如下特点:
①
强大的细胞毒活性。它对刺激因素产生的应答十分迅速，而且免疫应答强度高。
②
杀伤活性无需抗原刺激，也不受MHC分子的限制。病毒感染或恶性转化细胞的MHCⅠ类分子表达下降或消失，借这一机制逃避T细胞识别，但又能使NK细胞处于活化状态，从而与T细胞应答互为补充发挥免疫防御功能。
③
强大的细胞因子/趋化因子分泌功能，有助于启动和活化其他免疫细胞(如T细胞、B细胞、树突状细胞和内皮细胞等)的应答。因此，NK细胞在固有免疫和适应性免疫中均发挥重要作用。
[0004]目前体外激活扩增培养的NK细胞，一般纯度表型不稳定且纯度不高(纯因子培养不稳定，难保证效果)，并且，体外培养的NK细胞往往扩增倍数受限，细胞活性、杀伤活性也因此受到限制，培养时间长。现有技术中，常在NK细胞培养体系中添加细胞因子及饲养层细胞，以期提高NK细胞的体外培养效果，但效果仍非常有限。为此，本领域技术人员通过基因改造饲养层细胞来进一步提高NK细胞的培养效果，但截至目前为止，尚无法实现获得良好的增殖效果的前提下缩短培养周期。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供融合蛋白及其表达细胞株与应用，该融合蛋白表达于细胞膜表面，该细胞株用作NK细胞的饲养层细胞，能更好地促进NK细胞增殖。
[0006]本专利技术提供了一种融合蛋白，其包括IL
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15、IL
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18、IL
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21、IL
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2和4
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1BBL。
[0007]本专利技术对融合蛋白中，片段的连接顺序不做限定。在一些实施例中，所述的融合蛋白由C端至N端依次连接有IL
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15、IL
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18、IL
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21、IL
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2和4
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1BBL；相邻片段以P2A、T2A、F2A或E2A连接。
[0008]本专利技术所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]本专利技术实施例中，所述融合蛋白的C端还包括抗性蛋白片段。
[0010]一些实施例中，所述抗性蛋白为Bsd抗性蛋白。
[0011]本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核酸。
[0012]本专利技术中，所述核酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0013]本专利技术还提供了一种重组载体，其包括骨架载体和所述的核酸。
[0014]一些实施例中，所述骨架载体为慢病毒载体。
[0015]一些具体实施例中，所述慢病毒载体为pWPI载体。
[0016]本专利技术还提供了一种细胞株，其表达所述的融合蛋白。
[0017]本专利技术中，所述细胞株为表达所述的融合蛋白的人类体细胞或肿瘤细胞。
[0018]一些实施例中，所述人类体细胞为HEK293FT细胞；所述肿瘤细胞为K562细胞。
[0019]本专利技术所述细胞株的构建方法，其包括：将本专利技术所述的重组载体，包装成为慢病毒后浸染细胞获得所述细胞株。
[0020]本专利技术还提供了一种膜蛋白复合物的制备方法，其包括：将本专利技术所述细胞株接种于含有人血白蛋白的培养基，经辐照、裂解、过滤，收集含有膜蛋白复合物的滤液。
[0021]本专利技术所述的制备方法中所述培养基为KBM581。
[0022]一些实施例中，所述培养基与人血白蛋白的体积比为1:1。
[0023]一些实施例中，所述细胞株的接种密度为1
×
108cells/ml。
[0024]一些实施例中，所述辐照的强度为100～150Gy。
[0025]一些实施例中，所述裂解采用反复冻融法；所述过滤的滤网滤径为0.22μm。
[0026]本专利技术还提供了所述制备方法制得的膜蛋白复合物。
[0027]本专利技术所述的细胞株或所述的膜蛋白复合物，在NK细胞培养中的应用。
[0028]本专利技术还提供了一种NK细胞的培养基质，其包括：基础培养基、所述的膜蛋白复合物、干细胞培养上清液。
[0029]本专利技术中，所述基础培养基、膜蛋白复合物和干细胞培养上清液的体积比为1000:5:100。
[0030]本专利技术中，所述基础培养基为KBM581，所述干细胞培养上清液为脂肪干细胞的培养上清液。
[0031]本专利技术还提供了一种NK细胞的培养方法，其将NK细胞接种于培养基A，培养4d后，每48h补充新鲜的培养基质B；
[0032]所述培养基A为本专利技术所述的培养基质；
[0033]所述培养基B为本专利技术所述的培养基质。
[0034]本专利技术通过基因工程改造将融合蛋白(IL
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15、IL
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18、L
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21、IL
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2和4
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1BBL)表达在饲养层细胞表面，再裂解细胞形成抗原复合物，共培养可加强该蛋白对NK细胞的激活扩增效果。实验表明，无论是来源异体(异体外周血/脐血)或自体血，采用本专利技术方案均能稳定刺激扩增出高纯度高杀伤活性的NK细胞，通过体外采集分离，刺激扩增培养后NK细胞(CD3
‑
CD16+CD56+、NKG2D)平均能达到纯度90％以上，活化受体大幅度上升，NK细胞扩增倍数数千倍，杀伤活性高。
附图说明
[0035]图1示融合蛋白表达载体图谱；
[0036]图2示实验组A培养NK细胞的流式检测图；
[0037]图3示实验组B培养NK细胞的流式检测图；
[0038]图4示实验组C培养NK细胞的流式检测图；
[0039]图5示显微镜下实验组A的NK细胞形态，放大40倍；
[0040]图6示显微镜下实验组A的NK细胞形态，放大400倍；
[0041]图7示各组NK细胞对四种癌细胞的杀伤率；
[0042]图8示NK细胞活化受体百分比。
具体实施方式
[0043]本专利技术提供了融合蛋白及其表达细胞株与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本专利技术内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.融合蛋白，其包括IL
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15、IL
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18、IL
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21、IL
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2和4
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1BBL。2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，由C端至N端依次连接有IL
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15、IL
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18、IL
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21、IL
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2和4
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1BBL；相邻片段以P2A连接。3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。4.根据权利要求1～3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，其C端还包括抗性蛋白片段。5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗性蛋白为Bsd抗性蛋白。6.编码权利要求1～5任一项所述融合蛋白的核酸。7.根据权利要求6所述的核酸，其特征在于，其序列如SEQ ID NO:2所示。8.重组载体，其包括骨架载体和权利要求6或7所述的核酸。9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，所述骨架载体为慢病毒载体。10.根据权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pWPI载体。11.细胞株，其特征在于，其表达权利要求1～5任一项所述的融合蛋白。12.根据权利要求11所述的细胞株，其特征在于，其为表达权利要求1～5任一项所述的融合蛋白的人类体细胞或肿瘤细胞。13.根据权利要求12所述的细胞株，其特征在于，所述人类体细胞为HEK293FT细胞；...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玲洁，陈爱华，
申请(专利权)人：广东香雪干细胞再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：