基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒，该试剂盒包括Probe A、Probe B、Probe D、Probe E、聚合酶、切刻内切酶、辅酶因子、Tris

【技术实现步骤摘要】
基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，特定序列的核酸片段可以作为指示相应生物物种或生理病理状态的标记物。目前最常用的核酸检测方法为荧光定量PCR，可直接用于DNA的检测。若待测对象为RNA，则需将其先逆转录为DNA，然后进行扩增及后续的检测。一般而言，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。尽管该技术相对成熟，但PCR反应需要独立的实验环境，耗时长，成本相对较高。因此，开发能够提高效率、简化流程的新型核酸分析方案能够对生物医学研究及应用起到积极推动作用。<br/>
技术实现思路
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法为：提供单链DNA探针Probe A以及末端修饰有电信号分子的茎环结构探针Probe B，Probe A修饰在电极表面，Probe B通过Hoogsteen作用结合于Probe A上从而也修饰在该电极表面；提供茎环结构的探针Probe E，Probe E可以被目标核酸打开，并形成一个长茎小环的新型茎环结构，在聚合酶作用下该新型茎环结构与目标核酸发生链置换反应，取代目标核酸，形成的双链DNA拥有切刻内切酶位点，在聚合酶和切刻内切酶的共同酶促反应下产生更多的与目标核酸的序列相同的单链DNA；提供哑铃型探针Probe D，Probe D上具有Probe C序列；与目标核酸的序列相同的单链DNA能够通过杂交反应打开哑铃型探针Probe D，使Probe D上游离的5
’
端与3
’
端序列通过杂交生成环状DNA，该环状DNA两端的单链区域Probe C作为双足步行器的walker序列，与修饰于电极表面的Probe B作用构成DNAzyme结构，在辅酶因子作用下发生切割反应，使得电极的电化学信号强度降低，通过电化学信号强度的变化分析得到目标核酸的浓度。2.根据权利要求1所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，所述电极为金电极，Probe A通过金
‑
巯键修饰在该金电极表面。3.根据权利要求2所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，其中，通过调节溶液的pH值对Probe B与Probe A的结合与分离进行控制。4.根据权利要求3所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：1)金电极表面预处理；2)金电极表面核酸修饰：在金电极表面修饰Probe A，然后将Probe B结合在Probe A上，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；3)核酸定量分析：将待测核酸样本与Probe E、聚合酶、切刻内切酶混合孵育，然后加热使聚合酶、切刻内切酶失活；再加入Probe D和辅酶因子，充分混合，将得到的溶液滴加到修饰有Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。5.根据权利要求4所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，所述聚合酶为Klenow fragment，所述切刻内切酶为Nb.BbvCI，辅酶因子为镁离子。6.根据权利要求5所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：1)金电极表面预处理；2)金电极表面核酸修饰：按照以下配方配制电极固定液：Tris
‑
HCl、EDTA、TCEP、NaCl，pH＝7.4；使用电极固定液稀释Probe A，得到混合液1；将Probe B使用磷酸缓冲液稀释，得到混合液2；将表面预处理后的金电极插入混合液1中，于室温下反应，随后将金电极冲洗干净后置于巯基己醇中反应；再将金电极插入混合液2中，于室温下反应，得到修饰有Probe A和Probe B的金电极；3)核酸定量分析：
将待测核酸样本使用磷酸缓冲液稀释，然后与Probe E、Klenow fragment、Nb.BbvCI、dNTPs、NEB buffer 2.1混合，37℃下孵育，然后加热使Klenow fragment、Nb.BbvCI失活，得到混合液3；将混合液3与Probe D、镁离子充分混合，将得到的溶液滴加到修饰Probe A和Probe B的金电极表面，孵育后进行电化学检测；最后根据金电极的电化学信号强度的变化，结合预先建立的表征目标核酸浓度与电化学信号强度关系的标准曲线计算出待测核酸样本中目标核酸的浓度。7.根据权利要求6所述的基于环状双足DNA步行策略的核酸检测方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：1)金电极表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪鹏，柴华，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：