一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用，该检测方法包括：将核酸外切酶、检测样品和CDN混合孵育，灭活核酸外切酶，加入发夹探针，底物链，镁离子，根据冠状病毒标准曲线和反应体系的荧光强度计算检测样品中的冠状病毒浓度。本发明专利技术中的定量检测方法可以同时检测一种或多种冠状病毒，且灵敏度高，回收率值和相对标准偏差分别为95.8％～107％和4.3％～6.7％，线性范围10fM

【技术实现步骤摘要】
一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]冠状病毒属于套式病毒目，冠状病毒科，是目前自然界已知的最大RNA病毒。冠状病毒亚科分为四个属，包括α冠状病毒、β冠状病毒、γ冠状病毒和δ冠状病毒。新型冠状病毒因其传播迅速、发病率高和死亡率显著而对人类健康具有极大的危害性。因此，快速准确地诊断冠状病毒对于控制当前的新冠病毒疫情至关重要。
[0003]目前主要用于诊断冠状病毒的方法为聚合酶链反应(PCR)，使用PCR检测COVID
‑
19通常需要3个多小时，而且，根据研究发现，使用PCR方法检测COVID
‑
19容易存在假阴性病例。尤其是新冠病毒的重组和突变更是增加了检测单个靶区的PCR假阴性结果的风险，使得患者无法及时隔离和治疗，导致更广泛的传播。
[0004]因此，迫切需要开发一种能够高选择性检测不同类型冠状病毒的多功能定量检测方法，以获得更加准确的检测结果，从而切实有效的控制新冠病毒的传播。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种基于核酸四面体的冠状病毒定量检测方法及其应用，本专利技术中的冠状病毒定量检测方法可以实现同时定量检测多种冠状病毒的技术效果，且检测精度高，检出限低，检测耗时短，具有极好的实际应用价值。
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种冠状病毒定量检测试剂，该冠状病毒定量检测试剂中包括发夹探针、核酸四面体和底物链。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述核酸四面体由4条CDN探针链杂交得到，每一条CDN探针链均含有Mg
2+
依赖性DNA酶的亚单位，其中一条CDN探针链可与另外三条CDN探针链中的任一条杂交获得完整的Mg
2+
依赖性DNA酶链，另外三条CDN探针链之间无法杂交获得完整的Mg
2+
依赖性DNA酶链。
[0008]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述CDN探针链的核苷酸序列为：
[0009]CDN探针链A：CDN探针链A：
[0010]CDN探针链B：CDN探针链B：
[0011]CDN探针链C：CDN探针链C：
[0012]CDN探针链D：
[0013]其中CDN探针链中加粗部分为Mg2+依赖性DNA酶的亚单位，CDN探针链A的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列分别与CDN探针链B、C、D的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列在特定的底物链的干预下会形成完整的Mg2+依赖性DNA酶链。CDN探针链B、C、D的Mg2+依赖性DNA酶亚单位序列之间无法形成完整的Mg2+依赖性DNA酶链。
[0014]在本专利技术的一些优选实施方式中，核酸四面体(CDN)的构建方法为：取CDN探针链A，CDN探针链B，CDN探针链C，CDN探针链D混合(以HEPES缓冲液为溶剂)，90～92℃退火10～11min，然后在1min内冷却到4℃，即可。
[0015]组成动态网络(CDN)在控制细胞内转化中起着重要作用。现有技术中尚无基于CDN的冠状病毒诊断传感系统，而且，本专利技术还同时基于特殊的探针底物组合，使用DNA作为构建块来执行二进制算术处理，从而实现CDN与DNA生物计算系统的有机结合，使其能够执行基本、高级和复杂的逻辑功能，对冠状病毒诊断方法的开发起到了重要的推进作用。
[0016]在本专利技术的一些优选实施方式中，所述发夹探针靶向冠状病毒，其核苷酸序列分别为：
[0017]发夹探针H1：发夹探针H1：
[0018]发夹探针H2：发夹探针H2：
[0019]发夹探针H3：发夹探针H3：
[0020]发夹探针H4：发夹探针H4：
[0021]发夹探针H5：发夹探针H5：
[0022]其中，发夹探针H1、H4加粗部分靶向COVID
‑
19特异性序列，发夹探针H2、H5加粗部分靶向Bat
‑
SL
‑
CoVZC45特异性序列，发夹探针H3加粗部分靶向SARS
‑
CoV特异性序列。
[0023]根据本专利技术的第一个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述底物链的两端分别连接有荧光基团和淬灭基团，且所述底物链中含有Mg
2+
依赖性DNA酶的酶切位点。
[0024]底物链核苷酸序列分别为：
[0025]Sub
‑
AB：5'
‑
AGAGTATrAGGATATC
‑
3'(SEQ ID NO.10)；
[0026]Sub
‑
AC：5'
‑
TGACGATrAGGATATC
‑
3'(SEQ ID NO.11)；
[0027]Sub
‑
AD：5'
‑
TCAGGATrAGGATATC
‑
3'(SEQ ID NO.12)。
[0028]其中，rA为DNA酶的酶切位点。3条底物链的5
’
端和3
’
端均分别连接有荧光基团和淬灭基团。在本专利技术实施例中，Sub
‑
AB的5
’
端连接有FAM，3
’
端连接有BHQ1；Sub
‑
AC的5
’
端连接有ROX，3
’
端连接有BHQ2；Sub
‑
AD的5
’
端连接有Cy5，3
’
端连接有BHQ2。
[0029]当然，本领域技术人员也可以选择其他的荧光基团与淬灭基团的组合，所选择的各荧光基团的检测波长不同。
[0030]本专利技术的第二个方面，提供本专利技术第一个方面所述的冠状病毒定量检测试剂在制备冠状病毒定性检测产品中的应用。
[0031]根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述产品包括检测试剂盒和生物传感器。
[0032]根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述冠状病毒为β属冠状病毒；在本专利技术的一些优选实施方式中，所述冠状病毒包括COVID
‑
19、Bat
‑
SL
‑
CoVZC45和SARS
‑
CoV。
[0033]根据本专利技术的第二个方面，在本专利技术的一些实施方式中，所述冠状病毒定量检测产品的使用方法为：将核酸外切酶、检测样品和CDN探针链A、CDN探针链B、CDN探针链C、CDN探针链D混合孵育，灭活核酸外切酶，加入发夹探针H1(或替换为H4)、发夹探针H2(或替换为H5)、发夹探针H3中的至少一种，Sub
‑
AB、Sub
‑
AC、Sub
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述冠状病毒定量检测试剂中包括发夹探针、核酸四面体和底物链。2.根据权利要求1所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述核酸四面体由4条CDN探针链杂交得到，每一条CDN探针链均含有Mg
2+
依赖性DNA酶的亚单位，其中一条CDN探针链可与另外三条CDN探针链中的任一条杂交获得完整的Mg
2+
依赖性DNA酶链，另外三条CDN探针链之间无法杂交获得完整的Mg
2+
依赖性DNA酶链。3.根据权利要求1所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述发夹探针靶向冠状病毒。4.根据权利要求1或3所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述发夹探针包括：发夹探针H1：5'
‑
GAAGTGCTGTAGAGAGTCCATAGTTTTTTTACTATGGACTCTCTACAGCACTTCAATAGTAGTTGT
‑
3'(SEQ ID NO.5)；发夹探针H2：5'
‑
GAAGTGCTGTAGTGGTACGGTGATTTTTTTATCACCGTACCACTACAGCACTTCCTTCAACTGCAG
‑
3'(SEQ ID NO.6)；发夹探针H3：5'
‑
GAAGTGCTGTAGCGAGCTGAATCATTTTTTTGATTCAGCTCGCTACAGCACTTCCTCAGTAGTATC
‑
3'(SEQ ID NO.7)；发夹探针H4：5'
‑
TGATACTACAGAGTCCATAGTTTTTTTACTATGGACTCTGTAGTATCAAATAGTAGTTGT
‑
3'(SEQ ID NO.8)；发夹探针H5：5'
‑
TGATACTACTGGTACGGTGATTTTTTTATCACCGTACCAGTAGTATCACTTCAACTGCAG
‑
3'(SEQ ID NO.9)中的至少一种。5.根据权利要求2所述的冠状病毒定量检测试剂，其特征在于，所述CDN探针链包括：CDN探针链A：5'
‑
GATATCAGCGATACGCCTACAGCACTTCTTTTTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA
‑
3'(SEQ ID NO.1)；CDN探针链B：5'

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊华，刘承帅，潘家峰，邓芳，
申请(专利权)人：广东省科学院生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：