CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物检测领域，特别涉及CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其对非核酸目标物——微囊藻毒素
‑
LR的检测。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas系统由簇状规则间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）和CRISPR关联蛋白（CRISPR associated，Cas）组成，是一种古生菌和细菌的适应性免疫系统。由于其因其独特的精准识别能力，CRISPR/Cas系统不仅用于基因组编辑，还在被应用于生物传感领域。尽管基于CRISPR/Cas系统的生物传感策略已经取得了很好的进展和效果，如DETECTR和SHERLOCK，但是目前已建立的一系列基于CRISPR/Cas系统传感器存在以下局限性：（1）大多是将核酸扩增技术与CRISPR/Cas系统进行整合，这极大的增加了操作的专业性要求以及检测成本；（2）尽管基于CRISPR/Cas系统传感器逐渐被用于非核酸目标物检测，但CRISPR/Cas传感器在超灵敏检测生物毒素、蛋白、生物代谢物等非核酸目标物的潜力还有待发掘。
[0003]微囊藻毒素(MCs)是由铜绿微囊藻、水华藻、鱼腥藻和念珠藻等蓝藻产生的次级代谢物，在蓝藻生长的各个阶段均可生成，是淡水中分布最广泛的蓝藻毒素之一；其中微囊藻毒素
‑
LR（MC
‑/>LR）出现频率最高，含量最为丰富（约占天然水体中MCs总浓度的 99.8%），毒性最强。MC
‑
LR能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，影响miRNA的表达，损害肾脏、皮肤和生殖系统。研究表明其对实验室小白鼠的半数致死剂量为50 μg/kg。世界卫生组织规定生活饮用水卫生标准MC
‑
LR浓度限值为1.0 μg/L，我国的《地表水环境质量标准》及《生活饮用水卫生标准》也沿用了此标准。因此，发展MC
‑
LR的准确检测技术对维护地表水环境及保护人类健康具有重要意义。传统的MC
‑
LR实验室检测方法包括高效液相色谱、酶联免疫吸附法和液相色谱串联质谱等。尽管这些方法具有敏感性和准确性，但大多数方法需要复杂的操作程序和复杂的仪器。最近开发的以颜色变化作为信号输出的比色传感由于其简单、便携、易操作的优点在MC
‑
LR检测应用研究中引起了国内外学者的高度重视。但比色传感器通常灵敏度低，检出限高，无法实现对低浓度MC
‑
LR的检测。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种灵敏、准确的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器及其制备方法，以及该CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器在检测非核酸目标物中的应用，如MC
‑
LR的检测。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA
‑
Cas蛋白复合体；所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶由金属有机框架材料与DNA水凝胶复合
组成，且所述DNA水凝胶包含以下核苷酸序列的DNA链：oligo X：5
’‑
Acrydite
‑
TTTTTTTTTTCACAGATGAGTATC
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；oligo Y ：5
’‑
Acrydite
‑
TTTTTTTTTCTTGTCTCCCGAGAT
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示Linker：5
’‑
GATACTCATCTGTGATTTTTTTTTTTTATCTCGGGAGACAAG
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述sgRNA
‑
Cas蛋白复合体由Cas蛋白与其对应的sgRNA复合组成，所述sgRNA的部分核苷酸序列与待测目标物本身含有的靶标DNA或用于识别适配待测目标物的功能性核酸链的核苷酸序列互补。所述靶标DNA的核苷酸序列为任一单链DNA序列，其中37
‑
50 个碱基与sgRNA的核苷酸序列互补。
[0006]上述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，优选的，在包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶中，所含金属有机框架材料的终浓度为1
‑
5 mg/mL，所含DNA水凝胶的用量为10
‑
20 μL；在sgRNA
‑
Cas蛋白复合体溶液中，所含Cas蛋白的终浓度为0.01
‑
0.05 mg/mL，所含sgRNA的终浓度为0.1
‑
0.5 μmol/L。
[0007]优选的，所述金属有机框架材料包括Cu
‑
TCPP(Fe)、Zn
‑
TCPP(Fe)、Co
‑
TCPP(Fe)、Cd
‑
TCPP、Zn
‑
TCPP、Cu
‑
TCPP、UiO
‑
66和PCN
‑
222中的任意一种或多种，所述Cas蛋白为Cas14a蛋白或Cas12a蛋白；所述用于识别适配待测目标物的功能性核酸链为适配体，如MC
‑
LR适配体。
[0008]基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）将修饰有丙烯酰胺基的DNA链oligo X和oligo Y分别加入丙烯酰胺，混合后真空排气，再加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，真空反应后，分别得到高分子的聚丙烯酰胺Ps
‑
X和Ps
‑
Y；将所述高分子的聚丙烯酰胺Ps
‑
X和Ps
‑
Y与Linker、金属有机框架材料混合后，加热反应，冷却后形成凝胶；（2）制备sgRNA
‑
Cas蛋白复合体。
[0009]上述的制备方法，优选的，所述步骤（1）中，所述oligo X和oligo Y的终浓度各为30
‑
50μmol/L，所述丙烯酰胺的终浓度为1.5
‑
3 wt%，所述真空排气10
‑
15 min，所述过硫酸铵的终浓度为0.05
‑
1.4 wt%，所述四甲基乙二胺的终浓度为0.5
‑
2.8 wt%，所述真空反应的条件为：37 ℃真空反应10
‑
30 min；所述Ps
‑
X、Ps
‑
Y、Lin本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，包括包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶和sgRNA
‑
Cas蛋白复合体；所述包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶由金属有机框架材料与DNA水凝胶复合组成，且所述DNA水凝胶包含以下核苷酸序列的DNA链：oligo X：5
’‑
Acrydite
‑
TTTTTTTTTTCACAGATGAGTATC
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；oligo Y：5
’‑
Acrydite
‑
TTTTTTTTTCTTGTCTCCCGAGAT
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；Linker：5
’‑
GATACTCATCTGTGATTTTTTTTTTTTATCTCGGGAGACAAG
‑3’
，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述sgRNA
‑
Cas蛋白复合体由Cas蛋白与其对应的sgRNA复合组成，所述sgRNA的部分核苷酸序列与待测目标物本身含有的靶标DNA或用于识别适配待测目标物的功能性核酸链的核苷酸序列互补。2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，在包埋金属有机框架材料的DNA水凝胶中，所含金属有机框架材料的终浓度为1
‑
5 mg/mL，所含DNA水凝胶的用量为10
‑
20 μL；在sgRNA
‑
Cas蛋白复合体溶液中，所含Cas蛋白的终浓度为0.01
‑
0.05 mg/mL，所含sgRNA的终浓度为0.1
‑
0.5 μmol/L。3.根据权利要求1或2所述的CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器，其特征在于，所述金属有机框架材料包括Cu
‑
TCPP(Fe)、Zn
‑
TCPP(Fe)、Co
‑
TCPP(Fe)、Cd
‑
TCPP、Zn
‑
TCPP、Cu
‑
TCPP、UiO
‑
66和PCN
‑
222中的任意一种或多种；所述Cas蛋白为Cas14a蛋白或Cas12a蛋白；所述用于识别适配待测目标物的功能性核酸链为适配体。4.一种如权利要求1
‑
3中任一项所述CRISPR/Cas驱动的DNA水凝胶比色传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将修饰有丙烯酰胺基的DNA链oligo X和oligo Y分别加入丙烯酰胺，混合后真空排气，再加入过硫酸铵和四甲基乙二胺，真空反应后，分别得到高分子的聚丙烯酰胺Ps
‑
X和Ps
‑
Y；将所述高分子的聚丙烯酰胺Ps
‑
X和Ps
‑
Y与Linker、金属有机框架材料混合后，加热反应，冷却后形成凝胶；（2）制备sgRNA
‑
Cas蛋白复合体。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述oligo X和oligo Y的终浓度各为30
‑
50 μmol/L，所述丙烯酰胺的终浓度为1.5
‑
3 wt%，所述真空排气10
‑
15 min，所述过硫酸铵的终浓度为0.05
‑
1.5 wt%，所述四甲基乙二胺的终浓度为0.5
‑
2.8 w...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁萍，伍翩，开天瀚，陈翠梅，王丹琪，黄瑞雪，张竞文，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：