高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因及其应用，属于分子生物学及代谢工程学技术领域，基因为植物TA家族类基因，TA家族类基因为如下序列中任意一种：(1)如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的CsTA基因或如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的MrTA基因；(2)具有(1)的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)与(1)、(2)其中任一条的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本发明专利技术提供了催化没食子酸甲酯生物合成的基因CsTA与MrTA，从茶树的杨梅中克隆并验证了催化没食子酸甲酯生物合成的CsTA与MrTA基因，本发明专利技术还提供了分别含有CsTA与MrTA基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白。转基因工程菌和重组蛋白。转基因工程菌和重组蛋白。

【技术实现步骤摘要】
ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0013]本专利技术还提供了一种表达盒，包含上述高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因。
[0014]本专利技术还提供了一种重组植物表达载体，所述载体包含将上述高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因重组至pRSFDuet
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1载体上所获得的重组载体pRSFDuet
‑1‑
CsTA、或pRSFDuet
‑1‑
MrTA、或两者的组合。
[0015]本专利技术还提供了一种工程菌，其特征在于，所述工程菌为包含上述重组载体pRSFDuet
‑1‑
CsTA或pRSFDuet
‑1‑
MrTA的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
[0016]本专利技术还提供了一种上述基因在催化没食子酸甲酯生物合成中的应用。
[0017]本专利技术还提供了一种没食子酸甲酯的生物合成方法，其特征在于，向含有EGCG或PGG,且添加甲醇作为底物的反应体系中，加入上述基因组合的共表达重组蛋白，或者上述工程菌组合中分离纯化的任一重组蛋白CsTA或MrTA，通过酶催化反应，生物合成没食子酸甲酯。
[0018]本专利技术的有益效果是：
[0019]本专利技术提供了两种高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因CsTA与MrTA及其编码蛋白和应用，从茶树的杨梅中克隆并验证了催化没食子酸甲酯生物合成的CsTA与MrTA基因，本专利技术还提供了分别含有CsTA与MrTA基因的重组质粒、转基因工程菌和重组蛋白。本专利技术提供了两种高效安全的没食子酸甲酯生物合成技术，利用生物工程方法优化了酶反应的底物最适添加量及酶的最适反应条件，为实现没食子酸甲酯的商品化生产提供了基础。没食子酸甲酯作为一种重要的次生代谢物质，具有抗真菌、抗HIV
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1、抗炎、抗氧化，增强植物防御等特性，该类化合物已在各个科研领域得到了广泛的认可和利用，为药用化合物的生物合成奠定了坚实的基础。
附图说明
[0020]图1为本专利技术实施例中CsTA和MrTA重组蛋白的SDS
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PAGE蛋白电泳分析图；其中，M为蛋白Marker；两个条带分别为纯化后的CsTA和MrTA重组蛋白。
[0021]图2为本专利技术实施例中HPLC分析CsTA和MrTA重组蛋白以EGCG为底物时催化的酶活产物结果图。
[0022]图3为本专利技术实施例中HPLC分析CsTA和MrTA重组蛋白以PGG为底物时催化的酶活产物结果图。
[0023]图4为本专利技术实施例中重组蛋白CsTA和MrTA各自在不同缓冲液条件下的最适反应pH梯度曲线图。
[0024]图5为本专利技术实施例中重组蛋白CsTA和MrTA各自在最适pH条件下的最适反应温度梯度曲线图。
[0025]图6为本专利技术实施例中重组蛋白CsTA和MrTA各自以EGCG为底物时反应时间梯度曲线图。
[0026]图7为本专利技术实施例中重组蛋白CsTA和MrTA各自以PGG为底物时反应时间梯度曲线图。
[0027]图8为本专利技术实施例中重组蛋白CsTA和MrTA在体外通过酶反应催化EGCG或PGG和甲醇反应生成没食子酸甲酯的流程图。
[0028]图9为本专利技术实施例中重组表达载体pRSFDuet
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1的结构图谱。
具体实施方式
[0029]为了使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本专利技术。
[0030]1、材料
[0031](1)植物材料：舒茶早(Camelliasinensis(L.)O.Kuntze.var.sinensiscultivarShuchazao)，杨梅(Myricarubra(Lour.)S.etZucc.)采集茶树鲜叶和杨梅鲜叶，立即用液氮冷冻，存于
‑
80℃冰箱保存备用。
[0032](2)克隆感受态大肠杆菌细胞DH5α，表达宿主菌BL21(DE3)。
[0033](3)LB培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，加950mL纯水，超声至充分溶解后，用1mol/LNaOH溶液调节pH至7.0，加水定容至1L高压灭菌后即为液体培养基；LB固体培养基，按照每200mLLB液体培养基加3g琼脂粉混匀，121℃高压蒸汽灭菌15min。
[0034](4)卡那霉素母液(50mg/mL)：称取0.5g卡那霉素，溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，
‑
20℃保存。
[0035](5)异丙基硫代
‑
β
‑
D
‑
半乳糖苷(IPTG,1mol/L):称取2.383g粉末溶于10mL灭菌水，过滤除菌，分装小管，
‑
20℃保存。
[0036](6)蛋白纯化缓冲液(0.1mol/L磷酸盐缓冲液)：称取17.907gNa2HPO4·
12H2O和2.925gNaCl，用纯水定容至500ml,此为溶液I，称取3.1202gNaH2PO4·
2H2O和1.17gNaCl，用纯水定容至200ml,此为溶液II,以II调I至pH为7.4，最终得到的溶液为上样缓冲液，每100ml上样缓冲液添加1.02g咪唑，得到的溶液即为洗脱缓冲液。
[0037]若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0038]2、方法
[0039]2.1协同催化没食子酸甲酯生物合成的基因组合的克隆及表达
[0040]2.1.1 CsTA和MrTA基因的克隆
[0041](1)根据两个基因CsTA和MrTA的开放阅读框序列，设计带有表达载体pRSFDuet
‑
1的多克隆位点BamH I和Pst I特异引物。
[0042]引物序列如下所示：
[0043]CsTA正向引物:
[0044]5’‑
CATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGATGGATTCAATAGCCC
‑3’
；
[0045]CsTA反向引物：
[0046]5’‑
GCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCAATTTTCATTTACG
‑3’
；
[0047]MrTA正向引物：
[0048]5’‑
CATCACCATCATCACCACAGCCAGGATCCGATGGCGTCAAGCACTGG
‑3’
；
[0049]MrTA反向引物：
[0050]5’‑
GCCGCAAGCTTGTCGACCTGCAGTCAAGTTATG
‑3’
；
[0051](2)按照多糖多酚总RNA提取试剂盒说明书，分别从舒茶早鲜叶和杨梅鲜叶中提取出总RNA，利用反转录酶对总RNA进行反转录，获得茶树c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因，其特征在于，所述基因为植物TA家族类基因。2.根据权利要求1所述的高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因，其特征在于，所述TA家族类基因为如下序列中任意一种：(1)如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的CsTA基因或如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的MrTA基因；(2)具有(1)的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)与(1)、(2)其中任一条的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因，其特征在于，所述基因CsTA和基因MrTA是分别从茶树鲜叶和杨梅鲜叶中分离并克隆获得。4.根据权利要求1所述的高效催化没食子酸甲酯生物合成的基因，其特征在于，所述基因CsTA和基因MrTA的编码蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5.一种表达盒，其特征在于，包含如权利要求1
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4任一所述的高效催化没食...

【专利技术属性】
技术研发人员：高丽萍，陈一凡，代新龙，夏涛，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：