本发明专利技术公开了一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法，其以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再固定于所述载体的探针上，即得固定化酶系统。本发明专利技术提供的固定化多酶系统具有高酶负载量、高催化活性、优异的稳定性和重复使用性。此外，本发明专利技术还实现了纳米材料载体功能与催化功能的一体化，简化了多酶共固定化的操作流程，并显著降低了用酶成本，可广泛应用于多种生化催化、医学分析、医疗器件等领域。医疗器件等领域。医疗器件等领域。
【技术实现步骤摘要】
一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法
[0001]本专利技术属于固定化酶系统制备
，具体涉及一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建固定化多酶系统的方法。
技术介绍
[0002]多酶系统是多步级联反应的高效催化剂，对于生物医学和工业生产具有重要意义。近年来，研究者们致力于探究新型载体材料和固定化方法，通过将多种酶共固定化，在实现多酶系统的复杂功能的同时，提高多酶的稳定性和重复使用性。然而，固定化多酶体系仍面临着两大难题：一方面，固定化后多酶活性位点受到破坏，造成酶活的大量损失，严重影响了级联反应的效率；另一方面，对于传统的载体，如SiO2纳米粒子、磁性纳米粒子、聚合物等，比表面积较小且易团聚，导致固定化后酶蛋白负载较低，限制了固定化酶的进一步应用。
[0003]DNA定向固定化技术是基于DNA分子杂交的一种新型固定化方法。由于DNA分子具有优越的生物相容性和机械刚性，制备的固定化酶系统往往具有良好的稳定性和耐受性。此外，不同于传统的固定化方法，DNA短链作为载体和酶分子之间连接的桥梁，能够保证酶分子活性位点的充分暴露，有利于与底物充分接触，提高催化反应的效率。近年来，金属有机骨架(MOFs)因其结构稳定性、可调性和大的比表面积引起了广泛关注。值得注意的是，二维MOF(2D MOF)纳米片Cu
‑
TCPP(Fe)不仅是一种比表面大的优良载体，而且其自身具有类过氧化物酶性质，可以代替一种生物酶，在级联反应中发挥催化作用。
[0004]因此，本专利技术提供了一种基于2D MOF纳米材料和DNA定向固定化技术构建高催化效率、高酶负载的固定化多酶系统的方法。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种高催化效率、高酶负载的固定化多酶系统的固定化酶系统。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供上述固定化酶系统的构建方法。
[0007]专利技术思路：本专利技术选用2D MOF纳米片Cu
‑
TCPP(Fe)作为载体，同时利用其类过氧化酶性质，用以代替辣根过氧化物酶(HRP)，与葡萄糖氧化酶(GOD)形成级联反应。首先对2D MOF纳米片表面羧基进行活化，得到MOF
‑
COOH；接着添加氨基化的探针DNA分子P进行反应，得到DNA分子修饰的纳米片MOF
‑
DNA；在此基础上，通过DDI技术将GOD定向固定在纳米片表面，由此构建了MOF
‑
DDI酶多酶固定化系统。
[0008]为了解决上述第一个技术问题，本专利技术公开了一种固定化酶系统，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的具有类过氧化物酶性质二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再通过DNA定向固定化技术将酶固定于所述载体的探针上，即得纳米片状、尺寸为微米级的固定化酶系统。
[0009]其中，所述探针DNA分子P的核苷酸序列为5`NH
2 C6
‑
GCTACCAGTACACATCCGCAGTCATGACCT(SEQ ID NO：1)；所述DNA分子C的核苷酸序列为5`SH
‑
AGGTCATGACTGCGGATGTGTACTGGTAGC(SEQ ID NO：2)。
[0010]其中，所述二维MOF纳米材料的尺寸为1000
‑
4000nm。
[0011]其中，所述酶为葡萄糖氧化酶(GOD)。
[0012]为了解决上述第二个技术问题，本专利技术公开了上述固定化酶系统的制备方法，包括如下步骤：
[0013]S1：将羧基活化后的二维MOF纳米材料分散于水中，与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P反应，得到DNA分子接枝的复合纳米片，用纯水洗涤，去除未连接的探针DNA分子P，得到探针DNA分子P修饰的2D MOF复合纳米材料，即MOF
‑
DNA；
[0014]S2：将酶溶解于水中，与4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸
‑3‑
硫代
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯钠盐(SMCC)和DMF的混合溶液反应后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用纯水分散，得到酶
‑
SMCC复合物；
[0015]S3：将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C溶于水中，还原巯基后，与所述酶
‑
SMCC复合物反应，反应结束后，超滤管超滤洗涤多次，去除未结合的SMCC，然后用水分散，得到得酶
‑
DNA复合物；
[0016]S4：于乙醇和水的混合溶液中，所述MOF
‑
DNA与酶
‑
DNA复合物反应，反应结束后，纯水洗涤多次，即得固定化酶系统。
[0017]步骤S1中，所述羧基活化为将二维MOF纳米材料分散于MES缓冲液中，与EDC和NHS反应，得到羧基活化的纳米片，即MOF
‑
COOH。
[0018]其中，所述MES缓冲液为25mM，pH6.0的MES缓冲液；所述二维MOF纳米材料与EDC和NHS的质量比为(0.01
‑
0.2)：(0.1
‑
1)：1，优选为0.1：0.5：1；所述活化的温度为
‑5‑
5℃，优选为0℃；所述活化的时间为10
‑
40min，优选为30min。
[0019]步骤S1中，所述二维MOF纳米材料与水和探针DNA分子P(1OD)的用量比为2mg：(3
‑
7)mL：(500
‑
1500)μL，优选为2mg：5mL：1000μL；所述反应的温度为20
‑
30℃，优选为25℃；所述反应的时间为2
‑
10h，优选为6h。
[0020]步骤S2中，所述酶与水的用量比为1mg：(0.5
‑
1.5)mL，优选为1mg：1mL；所述酶与4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸
‑3‑
硫代
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯钠盐的质量比为1：(0.5
‑
1.5)，优选为1：1；所述SMCC和DMF的用量比为1mg：(40
‑
60)μL，优选为1mg：50μL；所述反应的温度为20
‑
30℃，优选为25℃；所述反应的时间为6h以上。
[0021]步骤S3中，所述还原巯基为将DNA分子C经20
‑
40mM(优选为30mM)的三(2羧乙基)膦的水溶液还原巯基；其中，所述DNA分子C与三(2本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种固定化酶系统，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P修饰的二维MOF纳米材料为载体，将酶与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C结合，再固定于所述载体的探针上，即得固定化酶系统。2.根据权利要求1所述的固定化酶系统，其特征在于，所述酶为葡萄糖氧化酶。3.权利要求1或2所述固定化酶系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将羧基活化后的二维MOF纳米材料与核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的探针DNA分子P反应，得到DNA分子接枝的复合纳米片，即MOF
‑
DNA；S2：将酶与4
‑
(N
‑
马来酰亚胺甲基)环己烷
‑1‑
羧酸
‑3‑
硫代
‑
N
‑
琥珀酰亚胺酯钠盐反应后，得到酶
‑
SMCC复合物；S3：将核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子C还原巯基后，与所述酶
‑
SMCC复合物反应，得到得酶
‑
DNA复合物；S4：于乙醇和水的混合溶液中，所述MOF
‑
DNA与酶
‑
DNA复合物反应，即得固定化酶系统。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述羧基活化为将二维MOF纳米材料与EDC和NHS反应；其中，所述二维MOF纳米材料与EDC和NHS的质量比为(0.01
‑
0.2)：(0.1
‑
1)：1；所述活化的温度为
‑5‑
5℃；所述活化的时间为10
‑
40min。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述二维MOF纳米材料与探针DNA分子P的用量比为2mg：(500
‑
1500)μ...
【专利技术属性】
技术研发人员：庄伟，唐婷，饶远，许敬亮，王志，应汉杰，欧阳平凯，刘金乐，熊文龙，吕永坤，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：
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