一种抗真菌的中药单体及检测方法技术

本发明专利技术属于中药技术领域，公开了一种抗真菌的中药单体及检测方法，所述抗真菌的中药单体包括抗真菌性的芦荟液汁主要活性成分蒽醌类化合物，所述蒽醌类化合物包括芦荟苷和芦荟大黄素。本发明专利技术能够有效扩大现有抗真菌药物储备池，拓展芦荟在微生物领域的应用，打破传统药物的抑菌杀菌作用，阻断菌丝发育以及感染毒力，使得有效治疗真菌感染的同时，真菌不易进化出新的耐药机制。本发明专利技术通过筛选首次发现芦荟苷及芦荟大黄素虽然不能直接抑制真菌生长，却能显著降低真菌对细胞的毒性作用，减轻对人体细胞的损伤，这是首次揭示芦荟来源的单体抑制真菌菌丝发育以及阻断真菌

【技术实现步骤摘要】
一种抗真菌的中药单体及检测方法


[0001]本专利技术属于中药
，尤其涉及一种抗真菌的中药单体及检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，由于HIV感染、遗传性免疫缺陷、术后患者等抗菌药和免疫抑制剂的广泛使用；肿瘤放化疗及侵入性诊断和治疗技术的运用，真菌感染率和死亡率明显升高。真菌感染包括浅部真菌感染和深部真菌感染，其致病菌包括念珠菌属、曲霉菌属、隐球菌属等。浅部真菌感染被认为是困扰过25％世界人口的问题；而深部真菌感染，如念珠菌血症和播散性念珠菌病，是极其严重的疾病。据统计，侵入性念珠菌病的死亡率为30％～40％。
[0003]目前临床上经典抗真菌药主要有棘白菌素类、多烯类、唑类。伴随着种类相对稀少的抗真菌药的广泛大量使用，尤其是不科学的预防性使用，甚至滥用，使得大量的真菌的耐药菌出现。临床真菌病原菌往往进化出一种以上的耐药机制，呈现多药耐药，使得临床的抗真菌药物失去治疗效用。由于真菌病原菌是真核生物，与人类基因组、细胞构造和信号转导途径具有显著的相似性，传统筛选的药物毒性和副作用较大且容易产生耐药。因此研发新型安全、高效广谱的抗真菌药物成了当务之急。
[0004]芦荟作为我国传统的中药具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、降血糖和降血脂等多种药理作用。中医典籍《本草纲目》记载“芦荟其功专于杀虫清热”。芦荟安全性高，已被国际上将芦荟从单纯草药原料扩展为食品添加剂、非处方药、保健品、护肤品及化工等原料，广泛应用于医药、保健和日常生活中。但是，现有技术中存在抗真菌药物匮乏、抗真菌药物毒副作用大等问题。
>[0005]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有抗真菌药物匮乏，且药物毒性和副作用较大，现有抗真菌药物主要通过直接杀菌或抑菌产生作用，容易产生耐药，抗真菌新药靶点缺乏。
[0006]解决以上问题及缺陷的难度为：传统直接杀菌或抑菌的抗真菌药物容易引起真菌耐药，且难以发现新的药物靶点。目前临床应用的抗真菌药物仅仅是对以前药物的简单修饰，还没有一种新类型(新作用机制)的抗真菌药物上市。真菌主要通过靶点突变和药物外排的增加，使得临床的抗真菌药物失去治疗效用。而且由于真菌和人体都为真核生物，具有相似的细胞结构、信号传导通路，许多抗真菌药物对人类细胞也具有一定作用，如一线唑类抗真菌药物可与人体细胞色素P450蛋白血红素辅基结合，因此具有一定的肝毒性。耐药菌株的出现和新药的缺乏，为了获得良好的治疗效果，在临床治疗过程中不得不提高抗真菌药物使用量和应用强度，这也增加了抗真菌药物的对人体的损害，大大限制了部分药物的使用。
[0007]解决以上问题及缺陷的意义为：发现新类型抗真菌药物，减少抗真菌药物的毒副作用，改善真菌耐药问题，扩大现有抗真菌药物储备池和抗真菌药物靶点，具有广阔的临床应用前景。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种抗真菌的中药单体及检测方法，旨在解决现有技术存在的抗真菌药物匮乏、抗真菌药物毒副作用大等问题。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种抗真菌的中药单体，所述抗真菌的中药单体，包括抗真菌性的芦荟液汁主要活性成分蒽醌类化合物；其中，所述蒽醌类化合物包括芦荟苷和芦荟大黄素。
[0010]进一步，所述抗真菌的中药单体包括芦荟来源的单体、芦荟单体类似物、芦荟单体异构体、芦荟单体衍生物、芦荟单体代谢物和/或芦荟单体活性盐、芦荟单体的提取物和/或组合物。
[0011]进一步，所述真菌包括对机体危害较轻的浅部真菌和危害严重的深部真菌；
[0012]其中，所述真菌优选白色念珠菌。
[0013]本专利技术的另一目的在于提供一种应用所述的抗真菌的中药单体的芦荟苷和芦荟大黄素抑制真菌菌丝发育的检测方法，所述芦荟苷和芦荟大黄素抑制真菌菌丝发育的检测方法包括以下步骤：
[0014]步骤一，将白色念珠菌置于RPMI 1640培养基中孵育，并通过向培养基内加入10％胎牛血清的方法诱导白色念珠菌菌丝形成；
[0015]步骤二，将芦荟苷和芦荟大黄素分别溶于DMSO中，至浓度为100mg/mL，于
‑
20℃冰箱中贮存待用；
[0016]步骤三，分别进行菌丝发育检测以及细胞损伤检测。
[0017]进一步，所述步骤一中的白色念珠菌为Candida albicans SC5314。
[0018]进一步，所述步骤一中的孵育条件为37℃，5％CO2。
[0019]进一步，所述步骤三中的菌丝发育检测方法包括：
[0020](1)用含10％胎牛血清的液体培养基将贮存的100mg/mL的芦荟苷或芦荟大黄素溶液分别配制成一系列稀释浓度的芦荟苷或芦荟大黄素药液。
[0021](2)将白色念珠菌细胞接种到96孔板中，每孔99μL，1
×
104个细胞，分别加入1μL芦荟苷或芦荟大黄素素药液；记录每一个孔的芦荟苷或芦荟大黄素的浓度，同时设置不加任何药物的空白对照组，做三个平行的96孔板，结果取平均值；将96孔板置于CYTATION5活细胞成像仪中，设置培养条件为37℃，5％CO2，动态成像20～24h观察菌丝的形成情况并检测菌丝直径。
[0022]进一步，所述步骤(1)中的液体培养基为RPMI 1640培养基。
[0023]进一步，所述步骤三中的细胞损伤检测方法包括：
[0024](1)将复苏好的人体细胞加入96孔板中，每孔100μL，1
×
104个细胞，于37℃，5％CO2的环境下培养24h。
[0025](2)取白色念珠菌细胞于DMEM培养基中制备菌悬液，血球计数板计数后，于20mL DMEM培养基中将真菌浓度稀释为105CFU/mL；加入菌液及不同浓度的芦荟苷或芦荟大黄素，于37℃，5％CO2的环境下培养20～24h；参照LDH试剂盒方法测试细胞释放到培养液中的LDH活性；在高对照孔中加入10μL Triton
‑
100裂解细胞，在低对照和背景Blank孔中加入10μL DMEM培养基，在37℃，5％CO2的环境下培养30min；96孔板离心2min，250g，从每个孔中吸取50μL上清液至新的96孔板中；在每个孔中加入50μL反应混合液后，在避光、室温条件下培养
30min；在每孔中加入25μL终止液后，立即用酶标仪测定490nm的吸光度，并计算细胞损伤率。
[0026](3)使用SPSS19.0软件进行统计分析；采用独立样本t检验、单因素方差分析ANOVA方法对组间差异进行检验和比较；P<0.05有统计学意义。
[0027]进一步，所述步骤(2)中的细胞损伤率的计算公式为：
[0028]细胞损伤率(％)＝[(A
‑
C)/(B
‑
C)]×
100；
[0029]其中，A为样品的吸光度，即样品孔
‑
样品Blank孔；B为高对照的吸光度，即高对照孔
‑
高对照Blank孔；C为低对照的吸光度，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
DMEM培养基，在37℃，5％CO2的环境下培养30min；96孔板离心2min，250g，从每个孔中吸取50μL上清液至新的96孔板中；在每个孔中加入50μL反应混合液后，在避光、室温条件下培养30min；在每孔中加入25μL终止液后，立即用酶标仪测定490nm的吸光度，并计算细胞损伤率；(3)使用SPSS19.0软件进行统计分析；采用独立样本t检验、单因素方差分析ANOVA方法对组间差异进行检验和比较；P<0.05有统计学意义。10.如权利要求9所述的芦荟苷和...

【专利技术属性】
技术研发人员：任彪，廖彬佑，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：