基于Fenton-亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于Fenton

【技术实现步骤摘要】
基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法


[0001]本专利技术涉及过氧化氢酶活性检测领域，具体涉及一种基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法。

技术介绍

[0002]CAT广泛存在于人体内，如肝脏、肾脏、红细胞、肌肉、小肠等组织，细胞代谢产生的毒性物质H2O2能迅速被CAT加以清除。不同个体CAT活性不一致，其活性大小可作为某些慢性疾病预防诊断的指标。因此，CAT活性测定在临床应用中越来越受人们的重视。文献报道了多种CAT活性测定方法，如滴定法、荧光检测法、紫外分光光度法、显色光度法等。近年来，褪色光度法因高灵敏性、低检测限而成为该领域一大亮点，然而基于Fenton试剂(H2O2/Fe
2+
)作用下的亚甲基蓝褪色光度法测定血清过氧化氢酶活性尚无报道。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，该方法的灵敏性、准确性及稳定性更具优势，并成功用于不同个体血清CAT活性分析。
[0004]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，基于Fenton试剂(H2O2/Fe
2+
)作用下的亚甲基蓝(methylene blue，MB)褪色体系完成过氧化氢酶(catalase，CAT)活性测定。还原型染料亚甲基蓝于665 nm波长处有最大吸收波，摩尔吸光系数达到9.5
×
10
4 L/mol
·
cm，在H2SO4介质中，Fe
2+
催化H2O2氧化亚甲基蓝发生褪色反应，CAT分解H2O2引起吸光度回位，基于CAT加入前后吸光度变化值
△
A与CAT活性的线性关系得到过氧化氢酶活性，其中，
△
A=
‑
0.0012+12.23 E(U/mL)，r=0.9976，最低检测限达到0.0024 U/mL；具体包括如下步骤：取血清样品10 μL于50 mL容量瓶中，加入H2O2底液3.00 mL，30℃恒温反应15 min，立即加入H2SO
4 1.00 mL终结酶促反应，充分震荡后依次加入亚甲基蓝溶液5.00 mL，FeSO
4 1.00 mL，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处的吸光度A；同步测定酶空白体系吸光度A0，测定时，取血清样品10 μL于50 mL容量瓶中，加入H2SO
4 1.00 mL终结酶促反应，充分震荡后，加入H2O2底液3.00 mL，30℃恒温反应15 min，依次加入亚甲基蓝溶液5.00 mL，FeSO
4 1.00 mL，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处测定酶空白体系吸光度A0；根据
△
A=
‑
0.0012+12.23 E(U/mL)，r=0.9976，计算血清样品CAT活性E(U/mL)。
[0005]本专利技术利用CAT对Fe
2+
‑ꢀ
H2O2‑
MB显色体系的抑制效应，完成了CAT活性快速检测，最低检出量可达到0.0024 U/mL，明显优于其它褪色光度法，可成功用于人体血清CAT活性
测定，为临床检验工作者提供诊断依据，也为新型CAT试剂盒开发研制提供理论保障。
附图说明
[0006]图1为全波长扫描吸收光谱。
[0007]图2为不同催化剂的催化作用比较图。
[0008]图3为亚甲基蓝用量的影响图。
[0009]图4为硫酸用量的影响图；图中：1
‑
MB+H2SO4；2
‑
MB+H2O2+H2SO4。
[0010]图5为底液H2O2用量的影响图。
[0011]图6为酶促反应时间的影响图。
具体实施方式
[0012]为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0013]试验资料1.1 仪器与试剂UV1102 紫外
‑
可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司)。
[0014]H2O2底液：将0.50 mL 30% H2O2稀释成250 mL，高锰酸钾法测定其浓度，根据测定值二次稀释为1 mmol/L (即1 μmol/mL)。
[0015]CAT标准溶液：1 U/mL。将CAT固体和蒸馏水按照1:10000的比列混合配制，高锰酸钾法测定其活性，根据测定结果二次稀释CAT标准液。
[0016]1 mol/L H2SO4；0.1 mmol/L亚甲基蓝溶液；0.01 mol/L FeSO4。
[0017]血清样品来自于健康群体，由甘肃医学院附属医院提供。
[0018]测定方法取血清样品10 μL于50 mL容量瓶中，加入H2O2底液3.00 mL，30℃恒温反应15 min，立即加入H2SO
4 1.00 mL终结酶促反应，充分震荡后依次加入亚甲基蓝溶液5.00 mL，FeSO
4 1.00 mL，室温反应5 min后定容，蒸馏水作参比，在1 cm吸收池中测定665 nm波长处的吸光度A。同步测定酶空白体系吸光度A
0 (方法同上，仅改变H2O2底液和H2SO4加入顺序，即在H2O2加入前完成酶失活)，根据
△
A (见2.4 CAT活性工作曲线)计算血清样品CAT活性E(U/mL)。
[0019]结果讨论2.1吸收光谱图1是全波长扫描吸收光谱。亚甲基蓝在可见光区665 nm处有强吸收(图1曲线a)，摩尔吸光系数达到9.5
×
10
4 L/mol
·
cm；当向亚甲基蓝中加入Fe
2+
和H2O2时，反应快速完成，10分钟内变为淡蓝色，吸光度趋近于0，但峰位未做改变(图1中的曲线b)，由此说明，亚甲基蓝与H2O2发生了简单的褪色反应；加入CAT后，褪色受抑制，吸光度线性递增(图1中的曲线c、d)。后续实验测定波长确定为665 nm。
[0020]褪色反应条件优化2.2.1催化剂优化选择
取H2O
2 底液3.00 mL，实验考察不同类型催化剂催化性能。结果表明：金属离子Fe
2+
和Fe
3+
对H2O2氧化亚甲基蓝褪色反应均有催化作用，但催化程度有差异。在亚甲基蓝基础上(图2中a曲线)；单纯加入H2O2，褪色不明显(图2中b曲线)；Fe
3+
对H2O2氧化亚甲基蓝褪色反应有微弱促进作用(图2中c曲线)；相对而言，Fe
2+
作用更为显著，其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：在H2SO4介质中，Fe
2+
催化H2O2氧化亚甲基蓝发生褪色反应，CAT分解H2O2引起吸光度回位，基于CAT加入前后吸光度变化值
△
A与CAT活性的线性关系得到过氧化氢酶活性，其中，
△
A=
‑
0.0012+12.23 E(U/mL)，r=0.9976，最低检测限达到0.0024 U/mL。2.如权利要求1所述的基于Fenton
‑
亚甲基蓝体系褪色光度法测定过氧化氢酶活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：取血清样品10 μL于50 mL容量瓶中，加入H2O2底液3.00 mL，30℃恒温反应15 min，立即加入H2SO
4 1.00 mL终结酶促反应，充分震荡后依次加入亚甲基蓝溶液5.00 m...

【专利技术属性】
技术研发人员：董娜，张爱菊，白莹，张小林，
申请(专利权)人：甘肃医学院，
类型：发明
国别省市：