一种检测MicroRNA-17的生物传感器制造技术

本发明专利技术属于传感器技术领域，提供了一种检测微MicroRNA的生物传感器，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1

【技术实现步骤摘要】
一种检测MicroRNA
‑
17的生物传感器


[0001]本专利技术属于传感器
，特别涉及一种核酸适配体检测MicroRNA
‑
17的生物传感器。

技术介绍

[0002]MicroRNA (miRNA)在正常组织、良性肿瘤和恶性肿瘤中表达水平的不同，使其成为肿瘤诊断和预后评估的重要生物标志物，这就凸显了发展高敏感性和特异性miRNA检测的紧迫性和重要性。然而，传统的实验方法如Northern blotting、RT
‑
PCR等因为其复杂的实验过程和较低的灵敏度限制了其应用。
[0003]CRISPR
‑
Cas系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats and crispr associated protein)作为原核生物的适应性免疫系统，已被广泛应用于真核生物的基因编辑。由前体crRNA (pre
‑
crRNA)加工产生的成熟CRISPR RNA (crRNA)对形成活性CRISPR效应复合物至关重要。Cas13a的特别之处在于，Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它将结合并切割其他的RNA。因cas13a蛋白具有高保真度和独特的靶标激活侧切活性，使该策略具有较高的灵敏度和特异性。

技术实现思路

[0004]为了实现对MicroRNA
‑
17更加灵敏、快速、低成本的检测，本专利技术提供了一种检测微MicroRNA的生物传感器。
[0005]一种检测MicroRNA
‑
17的生物传感器，包括核苷酸序列如SEQ ID NO: 1
‑
6所示的crRNA，发夹探针pre
‑
trigger、H1、H2、H3、H4和Cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂、H2O2。
[0006]优选地，上述传感器中还包括miRNA
‑
17标准溶液。
[0007]上述生物传感器可用于制备检测miRNA
‑
17试剂盒。
[0008]上述生物传感器或试剂盒在检测miRNA
‑
17中的应用。
[0009]具体地，上述应用包括以下步骤：（1）将发夹探针pre
‑
trigger、H1、H2、H3、H4和缓冲溶液共孵育，在水浴锅中完成退火，获得产物液；（2）将cas蛋白、crRNA、产物液及待测溶液在缓冲溶液中孵育，获得反应液；（3）在反应液中依次加入血红素、鲁米诺试剂和H2O2溶液，进行分光光度测定。
[0010]优选地，所述Cas13a蛋白与crRNA的摩尔比为2:1。
[0011]优选地，步骤（3）中，检测波长为400 nm
‑
600 nm。
[0012]本专利技术的检测原理如下：本专利技术的传感器在对miRNA
‑
17（CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG）进行检测时用到以下序列：crRNA：GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACCUACCUGCACUGUAAGCAC UUUG；
pre
‑
trigger：GGAATGTGTCACATTUUAATGTGTCACATTCC；H1：AATGTGACACATTTAAGCCACGAGTGTC；H2：GACACTCGTGGGACAGACGACACACGAG；H3：CTCGTGTGTCGTCCTATCAGATGCCTACGACAC；H4：GTGTCGTAGGCATCGGACACTCGTGGCTTAGATGCCT；其中crRNA和miRNA
‑
17的斜体部分为互补序列，pre
‑
tirgger和H1中单下划线部分为互补序列，H1和H2中斜体部分为互补序列，H2和H3中单下划线部分为互补序列，H3和H4中斜体部分为互补序列，H4和H1中单下划线部位为互补序列；如图1所示，当目标物存在时，可与crRNA结合，激活Cas13a的反式切割活性，将pre
‑
trigger切断，使发夹pre
‑
trigger之间不稳定，形成两条trigger链。两条trigger链都可以打开H1，H1又继而打开H2，H2打开H3，H3打开H4，触发杂交链反应（HCR反应），而H4又可与H1结合，释放trigger链，使其可以参与下一个循环。H1、H2、H3、H4的末端均为富G序列，通过上述无限次循环实现指数放大，产生大量的G四联体实现信号放大；随着各发卡探针暴露出G四联体，当加入血红素时，组装成类过氧化物酶，在H2O2存在时，进行氧化还原反应，催化鲁米诺试剂发光，从而通过测量化学发光强度来定量检测目标产物。
[0013]本专利技术具有以下优点：本专利技术利用Cas13/crRNA复合体对miRNA
‑
17的特异性识别和反式切割活性，利用trigger引发的杂交链反应实现了对目标物的循环放大；利用发夹末端的富G序列形成G四链体，通过类过氧化物酶催化鲁米诺试剂反应，实现了信号的检测。由于该传感器无酶参与，其检测方法操作简便、检测速度快。该传感器的构建简单，仅需两步，有效避免了多步加入样品可能带来的污染、繁琐的样品前处理过程，具有操作简单、反应速度快等优势；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制作该生物传感器的工艺成本低，且反应条件温和，反应速度快。
附图说明
[0014]图1为该实验的原理图；图2为pre
‑
trigger浓度优化检测结果图；图3为H1浓度优化检测结果图；图4为反应时间优化检测结果图；图5为传感器检测miRNA
‑
17的工作曲线。
具体实施方式
[0015]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0016]实施例1pre
‑
trigger浓度优化（1）在1.5mL离心管中，加入发夹pre
‑
trigger（终浓度分别为0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM）、H1（10
µ
M）、H2（10
µ
M）、H3（10
µ
M）、H4（10
µ
M）各10
µ
L，加入
10
µ
L10
×
buffer2.1，震荡混匀后放入95℃水浴锅5min，然后冷却至室温；（2）取2
µ
Lcas13a蛋白（100nM）、2
µ
LcrRNA（50nM）、1
µ
LmiRNA
‑
17、26.7
µ
L灭菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测MicroRNA
‑
17的生物传感器，其特征在于，包括核苷酸序列如SEQ ID NO: 1
‑
6所示的crRNA，发夹探针pre
‑
trigger、H1、H2、H3、H4和Cas13a蛋白、血红素、鲁米诺试剂、H2O2。2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，还包括miRNA
‑
17标准溶液。3.一种包含权利要求1
‑
2任一所述生物传感器的检测miRNA
‑
17的试剂盒。4.一种如权利要求1
‑
2任一所述生物传感器或如权利要求3所述的试剂盒在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王玉，朱镜儒，黄加栋，刘素，郭志强，李倩茹，姚玉颖，李宗强，李静静，张清心，徐婉晴，朱志学，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：