FAM60A修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及抑制间充质干细胞衰老的方法，提供了一种抑制间充质干细胞衰老的FAM60A修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用。本发明专利技术通过对FAM60A基因转录后水平的干预修饰来抑制脂肪来源间充质干细胞衰老，本发明专利技术提供的制备肝病治疗的生物制剂，其主要细胞组分AMSC

【技术实现步骤摘要】
FAM60A修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及抑制间充质干细胞衰老的方法，具体涉及通过FAM60A修饰来抑制脂肪来源间充质干细胞衰老，进而提高其增殖能力和治疗潜能的方法，即提供了一种抑制间充质干细胞衰老的FAM60A修饰的间充质干细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)已被证实具有强大的分化潜能、自我更新能力、免疫调节作用以及靶向治疗功能。MSC细胞移植已在多种退行性疾病和组织急慢性损伤治疗中显示出明确疗效。动物水平的研究显示，移植MSC能缓解小鼠急、慢性肝损伤模型的肝脏炎症、促进肝细胞再生。并且临床实验研究也显示，重肝患者输注MSC的耐受性良好，可显著改善肝脏功能、降低Child
‑
Pugh和MELD评分、减少腹水及总死亡率。因此，对于目前临床上尚无有效药物和治疗手段的重大疾病，如肝衰竭等，MSC移植有望作为一种极具前景的细胞治疗新策略，用以补充甚或替代因血浆及肝源短缺而受限的目前临床上肝衰竭治疗的两种主要方式，人工肝系统和肝移植。从而有效改善该类患者预后，降低其病死率。
[0003]虽然MSC在再生医学及肝病治疗中的作用已备受肯定，但其疗效仍存在局限性。其中增殖、分化和归巢能力差等许多缺陷，可能与其细胞衰老有关。这是由于为了满足治疗所需的细胞量，在MSC移植前往往需要进行体外扩增，这就为复制所诱导的细胞衰老提供了机会。此外，从老年人及代谢性疾病患者身上获取的MSCs也往往具有更高的衰老负荷。因此，缓解甚至抑制MSC衰老，消除衰老相关的细胞功能损伤，有望显著提高MSC移植后的治疗效果。
[0004]我们在前期研究已成功建立了从脂肪组织分离培养MSC的技术。脂肪来源的MSC(AMSC)较之骨髓来源的MSC，其来源更为丰富，获取更为方便，扩增效率更高，因此在临床上具有良好的应用前景。但是我们在小鼠(mAMSC)及人的AMSCs(hAMSC)的体外培养扩增过程中均发现，随着体外传代次数的增加，AMSC表现出明显的衰老特征，如SA
‑
β
‑
gal染色增加，胞内p21和p16的蛋白表达水平升高，细胞和上清中细胞衰老相关分泌表型(SASP)相关因子水平也显著增加，并伴随着细胞增殖速率降低，细胞显著增大并呈扁平化以及细胞核的空泡化。同时，细胞线粒体也出现融合增大，线粒体ROS水平上调。另外，采用出现衰老表型的AMSC进行小鼠肝损伤及肝衰竭模型的治疗，发现其疗效亦显著降低，在抑制肝脏炎症、修复肝脏损伤、恢复肝功能等多个方面均与未衰老(状态良好)AMSC的疗效存在显著差异，甚至较之溶剂对照组无明确疗效。我们还发现，在化疗药物诱导的细胞衰老模型中，伴随着衰老表型的出现，AMSC中FAM60A(序列相似性家族60成员A)分子的水平显著升高，提示抑制或敲除FAM60A有望作为缓解AMSC衰老的方法。但采用CRISPR
‑
Cas9敲除细胞中的FAM60A，反而导致细胞增殖的停滞。因而，本专利技术旨在提供一种通过表观遗传学修饰来可逆化调控FAM60A水平，从而缓解甚或抑制AMSC衰老，进而提高AMSC在肝衰竭等重大肝脏疾病中的治疗潜能的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是要提供一种缓解甚或抑制AMSC衰老的修饰(/改造)方法，具体涉及干预AMSC中FAM60A蛋白水平的表观遗传学修饰方法，以及FAM60A修饰的AMSC(AMSC
‑
FAM60A)的在制备肝病治疗生物制剂中的用途。
[0006]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0007]本专利技术提供FAM60A修饰的脂肪来源的间充质干细胞，
[0008]脂肪来源的间充质干细胞为成人脂肪来源的间充质干细胞hAMSC时，FAM60A干预RNA为双链RNA组合，片段序列如SEQ:NO.1—SEQ:NO.8所示，包含hFAM60A mRNA的3
’‑
UTR区400
‑
2100范围内的4个短片段的反向互补序列：
[0009]SEQ:NO.1
‑
2：
[0010]5’‑
CAAAGAAGUAUAUGCAUAGGAA
‑3’
[0011]3’‑
GUUUCUUCAUAUACGUAUCCUU
‑5’
[0012]SEQ:NO.3
‑
4：
[0013]5’‑
AGCUAUGCCAGCAUCUUGCCU
‑3’
[0014]3'
‑
UCGAUACGGUCGUAGAACGGA
‑5’
[0015]SEQ:NO.5
‑
6：
[0016]5’‑
GUACUGUAGCACUGUAAGCACUUUG
‑3’
[0017]3'
‑
CAUGACAUCGUGACAUUCGUGAAAC
‑5’
[0018]SEQ:NO.7
‑
8：
[0019]5’‑
AGUACAUCAUCUAUACUGUA
‑5’
[0020]3'
‑
UCAUGUAGUAGAUAUGACAU
‑3’
；
[0021]脂肪来源的间充质干细胞为小鼠脂肪来源的间充质干细胞mAMSC时，用于mAMSC
‑
FAM60A构建的FAM60A干预RNA组合包含目的片段序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.9—SEQ:NO.14段的反向互补序列：
[0022]SEQ:NO.9
‑
10：
[0023]5’‑
UAACCAAUGUGCAGACUACUGU
‑3’
[0024]3'
‑
AUUGGUUACACGUCUGAUGACA
‑5’
[0025]SEQ:NO.11
‑
12：
[0026]5’‑
GUACUGUACGUGACACAGCACUUUA
‑3’
[0027]3'
‑
CAUGACAUGCACUGUGUCGUGAAAU
‑5’
[0028]SEQ:NO.13
‑
14：
[0029]5’‑
AGUACAUCAUCUAUACUGUA
‑3’
[0030]3'
‑
UCAUGUAGUAGAUAUGACAU
‑5’
。
[0031]本专利技术还提供FAM60A修饰的间充质干细胞的修饰方法，采用干预脂肪来源的间充质干细胞中FAM60A蛋白水平的表观遗传学修饰方法。
[0032]包括如下步骤：
[0033]1)第2代AMSC细胞接种于六孔板中，细胞融合度达30％
‑
50％时进行转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.FAM60A修饰的脂肪来源的间充质干细胞，其特征在于：其中，脂肪来源的间充质干细胞为成人脂肪来源的间充质干细胞hAMSC时，FAM60A干预RNA为双链RNA组合，片段序列如SEQ:NO.1—SEQ:NO.8所示，包含hFAM60A mRNA的3
’‑
UTR区400
‑
2100范围内的4个短片段的反向互补序列：SEQ:NO.1
‑
2：5
’‑
CAAAGAAGUAUAUGCAUAGGAA
‑3’3’‑
GUUUCUUCAUAUACGUAUCCUU
‑5’
SEQ:NO.3
‑
4：5
’‑
AGCUAUGCCAGCAUCUUGCCU
‑3’
3'
‑
UCGAUACGGUCGUAGAACGGA
‑5’
SEQ:NO.5
‑
6：5
’‑
GUACUGUAGCACUGUAAGCACUUUG
‑3’
3'
‑
CAUGACAUCGUGACAUUCGUGAAAC
‑5’
SEQ:NO.7
‑
8：5
’‑
AGUACAUCAUCUAUACUGUA
‑5’
3'
‑
UCAUGUAGUAGAUAUGACAU
‑3’
；脂肪来源的间充质干细胞为小鼠脂肪来源的间充质干细胞mAMSC时，用于mAMSC
‑
FAM60A构建的FAM60A干预RNA组合包含目的片段序列如SEQ:NO.1和SEQ:NO.9—SEQ:NO.14所示，其特征为包含mFAM60A mRNA的3
’‑
UTR区的200
‑
1800范围内的4个短片段的反向互补序列：SEQ:NO.9
‑
10：5
’‑
UAACCAAUGUGCAGACUACUGU
‑3’
3'
‑
AUUGGUUACACGUCUGAUGACA
‑5’
SEQ:NO.11
‑
12：5
’‑
GUACUGUACGUGACACAGCACUUUA
‑3’
3'
‑
CAUGACAUGCACUGUGUCGUGAAAU
‑5’
SEQ:NO.13
‑
14：5
’‑
AGUACAUCAUCUAUACUGUA
‑3’
3'
‑
UCAUGUAGUAGAUAUGACAU
‑5’
。2.权利要求1所述的FAM60A修饰的间充质干细胞的修饰方法，其特征在于：采用干预脂肪来源的间充质干细胞中FAM60A蛋白水平的表观遗传学修饰方法。3.根据权利要求2所述的修饰方法，其特征在于：包括如下步骤：1)第2代AMSC细胞接种于六孔板中，细胞融合度达30％
‑
50％时进行转染；2)配制转染试剂：取7.5μl Lipofectamine RNAiMAX稀释到142.5μl Opti
‑
MEM
TM
培养基中，轻轻混匀；3)配制FAM60A干预RNA：在1.5ml EP管中加入144μl Opti
‑
MEM
TM
培养基和
‑
20℃预冷的6μl FAM60A干预RNA 20μM；4)将稀释好的FAM60A干预RNA与稀释好的转染试剂轻柔混合，在室温下孵育10分钟；取250μl孵育好的复合物，滴加到1750μl完全培养基中，同时混匀；
5)转染6h后换完全培养基，再继续培养42h，然后常规传代；6)每2或3代重复上述步骤一次，获得AMSC
‑
FAM60A。4.根据权利要求2所述的修饰方法，所述脂肪来源的间充质干细胞为成人脂肪来源的间充质干细胞hAMSC，具体包括如下步骤：(1)脂肪来源的间充质干细胞的制备：分离hAMSC，添加L
‑
谷氨酰胺作为完全培养基进行培养扩增；脂肪来源的间充质干细胞增殖接近75％融合时，进行消化、传代；(2)FAM60A干预的hAMSC的构建：1)转染前一天将第2代hAMSC细胞接种到六孔板中，使第二天用于转染的细胞融合度达30％
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50％；2)配置含血清的完全培养基，注意不要加入抗生素；3)取7.5μl Lipofectamine RNAiMAX试剂稀释到142.5μl Opti
‑
MEM
TM
培养基中，在1.5ml EP管中轻轻混匀；4)取出
‑
20℃预冷的浓度为20μM的FAM60A干预RNA储存液；在1.5ml EP管中加入144μl Opti
‑
MEM
TM
培养基和6μl FAM60A干预RNA；FAM60A干预RNA为双链RNA组合，片段序列如SEQ:NO.1—SEQ:NO.8所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘艳宁，楼国华，岑叶蕾，齐津津，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：