用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法；包括提取cfDNA样本，基于提取的cfDNA样本，配置用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增，对扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序，采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息，本发明专利技术可对BRAF基因第12外显子检出含0.09％的BRAF基因相关位点突变的游离核酸样本，对第15外显子检出含0.05％的BRAF基因相关位点突变的游离核酸样本，可提高BRAF基因相关位点生物临床检测水平，为普及应用奠定基础。为普及应用奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法。

技术介绍

[0002]成人朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)的临床特征和预后因素尚不明确。但已在LCH中发现了重现性的BRAF V600E等位点的体细胞突变，而且多数基因组分析来自于儿童，初诊LCH组织标本中，进行一代包加二代包基因外显子突变检测，63.2％患儿存在BRAF基因突变，突变位点主要集中在第12和第15两个外显子上。p.V600E型占到50.6％；非p.V600E型突变阳性率为12.6％，包括：p.N486_T491delinsK、p.V600D(c.1799_1800delinsAT)、p.N486_P490del、p.L485_P490delinsF，以及三种散发阳性突变(p.V600D(c.1799_1800delinsAC))、p.V600delinsDATV和p.V487_T491del。
[0003]但目前缺乏技术便于对BRAF基因以上位点进行突变检测，难以对患者治疗过程以及康复出院之后的突变进行预测或监测。

技术实现思路

[0004]针对上述现有技术的不足，本专利技术所要解决的问题是：如何提供一种用于检测BRAF基因突变的引物组合、试剂盒、模型、构建方法及检测方法，以解决现有技术中对BRAF基因相关位点突变检测不便的问题。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术采用了如下的技术方案：
[0006]一种用于检测BRAF基因突变的引物组合，包括用于检测BRAF基因第12个外显子和/或第15个外显子的特异性引物，
[0007]所述用于检测BRAF基因第12个外显子的特异性引物为：
[0008]Exon12
‑
F：GGTGATGTGGCAGTGAAAATGT，
[0009]Exon12
‑
R：ACTCCTACTTCATTTTTGAAGGCT；
[0010]所述用于检测BRAF基因第15个外显子的特异性引物为：
[0011]Exon15
‑
F：CACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT，
[0012]Exon15
‑
R：TCAAACTGATGGGACCCACTC。
[0013]一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括上述用于检测BRAF基因突变的引物组合。
[0014]具体的，所述用于检测BRAF基因突变的试剂盒包括用于第一次PCR扩增的试剂盒和用于第二次PCR扩增的试剂盒；所述用于第一次PCR扩增的试剂盒包括权利要求1所述用于检测BRAF基因突变的引物组合和2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix；所述用于第二次PCR扩增的试剂盒包括2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、PE 1.0和Barcode。
[0015]一种用于检测BRAF基因突变的反应体系，包括用于第一次PCR扩增的反应体系和
用于第二次PCR扩增的反应体系；
[0016]所述用于第一次PCR扩增的反应体系包括：
[0017]25体积份的2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、3体积份的权利要求1所述用于检测BRAF基因第12个号显子和/或第15个号显子的特异性引物和22体积份的游离核酸样本；
[0018]所述用于第二次PCR扩增的反应体系包括：
[0019]25体积份的2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、1体积份的PE 1.0、1体积份的Barcode和23体积份的第一次PCR扩增后纯化DNA产物。
[0020]一种构建检测BRAF基因突变模型的方法，包括：
[0021]1)、提取cfDNA样本；
[0022]2)、基于提取的cfDNA样本，配置上述用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增；
[0023]3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；
[0024]4)、采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到所述cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点的相关信息，构建所述检测BRAF基因突变模型。
[0025]采用正常cfDNA样本，建立的所述检测BRAF基因突变模型，输入待测样本进行检测，与所述正常cfDNA样本的BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点相关信息进行比对。
[0026]具体的，BRAF基因第12号外显子和第15号外显子特定位点包括：
[0027]所述BRAF基因第12号外显子特定位点为：c.1459_1473del:p.V487_T491del和/或c.1458_1472del:p.N486_T491delinsK和/或c.1457_1471del:p.N486_P490del和/或c.1455_1469del:p.L485_P490delinsF；
[0028]所述BRAF基因第12号外显子特定位点为：c.1799_1800delinsAT:p.V600D和/或c.c.1798_1799insATGCTACAG:p.V600delinsDATV和/或c.1799T>A:p.V600E和/或c.1801A>C:p.K601Q和/或c.1799_1800delinsAC:p.V600D。
[0029]进一步，所述步骤1)提取的cfDNA样本浓度为0.1ng/ul
‑
50ng/ul。
[0030]具体的，所述步骤2)相应进行PCR扩增包括：
[0031]第一次PCR扩增程序为：95℃、3min，循环一次；98℃、20s，60℃、15s，72℃、15s，循环30次；72℃、1min，循环一次；4℃保持；
[0032]第二次PCR扩增程序为：98℃、5min，循环一次；98℃、20s，65℃、30s，72℃、20s，循环30次；72℃、5min，循环一次；4℃保持。
[0033]上述构建检测BRAF基因突变模型的方法所构建的检测BRAF基因突变的模型。
[0034]一种检测BRAF基因突变的非疾病诊断的方法，包括：
[0035]1)、基于上述检测BRAF基因突变的模型，提取待测cfDNA样本；
[0036]2)、基于提取的待测cfDNA样本，配置权利要求4所述用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增；
[0037]3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测BRAF基因突变的引物组合，其特征在于，包括用于检测BRAF基因第12个外显子和/或第15个外显子的特异性引物，所述用于检测BRAF基因第12个外显子的特异性引物为：Exon12
‑
F：GGTGATGTGGCAGTGAAAATGT，Exon12
‑
R：ACTCCTACTTCATTTTTGAAGGCT；所述用于检测BRAF基因第15个外显子的特异性引物为：Exon15
‑
F：CACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCT，Exon15
‑
R：TCAAACTGATGGGACCCACTC。2.一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述用于检测BRAF基因突变的引物组合。3.如权利要求2所述用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于，包括用于第一次PCR扩增的试剂盒和用于第二次PCR扩增的试剂盒；所述用于第一次PCR扩增的试剂盒包括权利要求1所述用于检测BRAF基因突变的引物组合和2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix；所述用于第二次PCR扩增的试剂盒包括2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、PE 1.0和Barcode。4.一种用于检测BRAF基因突变的反应体系，其特征在于，包括用于第一次PCR扩增的反应体系和用于第二次PCR扩增的反应体系；所述用于第一次PCR扩增的反应体系包括：25体积份的2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、3体积份的权利要求1所述用于检测BRAF基因第12个号显子和/或第15个号显子的特异性引物和22体积份的游离核酸样本；所述用于第二次PCR扩增的反应体系包括：25体积份的2
×
KAPA HiFi Hotstart Ready Mix、1体积份的PE 1.0、1体积份的Barcode和23体积份的第一次PCR扩增后纯化DNA产物。5.一种构建检测BRAF基因突变模型的方法，其特征在于，包括：1)、提取cfDNA样本；2)、基于提取的cfDNA样本，配置权利要求4所述用于检测BRAF基因突变的反应体系并相应进行PCR扩增；3)、对所述步骤2)扩增产物进行加接头及PCR富集制备测序文库，对所述测序文库进行定量与质控，采用基因测序仪进行高通量测序；4)、采用生物信息分析软件对测序数据分析，得到所述cfDNA样本的BRAF...

【专利技术属性】
技术研发人员：伍建，姬晓雯，武璇，
申请(专利权)人：迈基诺重庆基因科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：