一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒、制备方法及应用，本发明专利技术将一种表达融合蛋白CD137L

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于医学生物制品领域，特别适用于一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]CD137L(CD137配体)，又名4
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1BBL，属于肿瘤坏死因子超家族成员，是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白。4
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1BBL，以同源三聚体存在，以延伸的三叶样螺旋结构为特征，发挥其生物学功能。它作为CD137的高亲和力配体,表达于活化的抗原递呈细胞(APC)表面,包括巨噬细胞、B细胞和树突状细胞及多种肿瘤细胞的表面等。作为一对重要的共刺激分子，CD137L与CD137通过在免疫细胞间传递活化、增殖或者凋亡信号来调节T细胞介导的免疫反应。
[0003]CD137L与其受体结合，可启动双向信号转导：正向信号可刺激T细胞活化和增殖；反向信号可刺激B细胞增殖。CD137L及其受体在正常组织及炎症中表达不显著，而在肿瘤组织中呈现高水平表达，这种表达异常与肿瘤发生、恶化存在一定的相关性。肿瘤细胞介导的CD137L/CD137异常表达已在很多肿瘤中被发现，包括直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌等恶性肿瘤。因此，以CD137L与其受体结合作为靶点开展相关研究已成为当前抗肿瘤免疫研究领域的一大热点。因而，以CD137L/CD137为靶抗原开展药物研究，通过诱导机体产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来实现抗肿瘤免疫治疗有着很强的临床应用潜力。目前，已有针对CD137L/CD137的抗肿瘤治疗主要以抗体治疗为主，如辉瑞公司研发的全人源化CD137单抗Utomilumab(PF
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05082566)，被批准用于晚期实体瘤和恶性B细胞白血病的Ⅰ期临床(NCT01307267)试验，该药物临床耐受性良好，且展现出一定的抗肿瘤治疗效果。但是，由于肿瘤细胞的免疫逃逸，使得单抗类药物的治疗存在较大几率的耐药性。因此，通过激活机体自身的细胞免疫来实现抗肿瘤治疗成为了一种研发思路。重组腺病毒载体作为一种新型的治疗手段，在肿瘤治疗领域已有一些应用，借助重组腺病毒载体诱导机体产生针对CD137L/CD137的特异性细胞免疫是肿瘤生物治疗的一种新思路。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种具有抗肿瘤免疫功能的重组腺病毒，将CD137L
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PP4的核苷酸序列通过同源重组插入腺病毒载体构建得到一个能够表达CD137L
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PP4蛋白的重组腺病毒(rAd
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CD137L
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PP4)，该重组腺病毒诱导机体产生针对CD137L的特异性细胞免疫反应，并且具有诱导机体产生针对CD137L的特异性细胞免疫和抑制肿瘤细胞增殖的功能。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：
[0006]一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，是表达融合蛋白CD137L
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PP4的重组腺病毒，所述融合蛋白CD137L
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PP4是将人CD137L序列的蛋白与一个通过筛选获得的具有T细胞激活功能的多肽PP4通过连接序列进行连接获得。
[0007]进一步地，所述CD137L
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PP4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1
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246位为CD137L蛋白，第247
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250位为两个蛋白之间的连接序列，第251
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265位为PP4多肽，所述多肽
PP4的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，该序列来自白喉毒素无毒突变体中的第113
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127位序列，该序列具有促进淋巴细胞增殖的作用。
[0008]进一步地，所述编码CD137L
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PP4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，所述腺病毒载体是5型腺病毒载体、26型腺病毒载体或28型腺病毒载体。
[0010]本专利技术所述rAd
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CD137L
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PP4重组腺病毒载体的构建方法，具体为：
[0011]将人工合成编码融合蛋白CD137L
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PP4的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)插入通过分子克隆技术插入腺病毒载体。所得重组腺病毒再经过细胞培养、增殖和层析柱纯化得到所需的重组腺病毒样品。
[0012]进一步地，具体包括以下步骤：
[0013]1)人工合成SEQ ID NO.2序列，通过同源重组的方法插入腺病毒载体，构建得到重组腺病毒rAd
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CD137L
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PP4。
[0014]2)用HEK293细胞培养步骤1)所述重组腺病毒获得病毒培养液，经三次反复冻融后收集上清，用超滤方法对所得上清进行浓缩，获得病毒浓缩液。
[0015]3)将步骤2)所述病毒浓缩液，先用阴离子交换层析进行纯化，再用分子筛层析进行纯化得到病毒纯化液。
[0016]进一步地，步骤2)所述超滤方法，可以是切向流超滤方法。
[0017]进一步地，步骤3)所述阴离子交换层析所用的填料可以是SOURCE30Q或者DEAE。
[0018]进一步地，步骤3)所述分子筛层析所用的填料可以是Superdex200pg。
[0019]本专利技术的有益效果是：本专利技术的一种表达CD137L
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PP4蛋白基因插入腺病毒载体，使得该重组腺病毒能在体内表达，诱导产生特异性的抗肿瘤细胞免疫，实现肿瘤的免疫治疗。
附图说明
[0020]图1为白喉毒素无毒突变体蛋白的T细胞活性多肽对T细胞增殖作用的结果；
[0021]图2为pDC316
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CD137L
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PP4重组穿梭质粒图；
[0022]图3为免疫荧光检测表达结果图(A:空白细胞，B:表达CD137L
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PP4重组腺病毒感染后细胞，C：空白细胞免疫荧光照片，D:表达CD137L
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PP4重组腺病毒感染后细胞免疫荧光照片)
[0023]图4为小鼠特异性细胞免疫检测结果图(A：表达CD137L
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PP4重组腺病毒组，B：表达CD137L重组腺病毒组、C：空腺病毒组，D：空白组)；
[0024]图5为TC
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1小鼠肿瘤模型肿瘤细胞增殖抑制实验结果图(A：表达CD137L
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PP4重组腺病毒组，B：空腺病毒组、C：空白组)
具体实施方式
[0025]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0026]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的
技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，其特征在于，所述具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒表达融合蛋白CD137L
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PP4，所述融合蛋白CD137L
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PP4包含CD137L蛋白和具有T细胞激活功能的PP4多肽。2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，其特征在于，所述PP4多肽来自白喉毒素无毒突变体蛋白中的第113
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127位序列，该序列具有促进淋巴细胞增殖的作用。3.根据权利要求2所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，其特征在于，所述CD137L蛋白和具有T细胞激活功能的PP4多肽通过连接序列GGGS连接，所述融合蛋白CD137L
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PP4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，其特征在，编码所述融合蛋白CD137L
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PP4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒，其特征在于，所述腺病毒载体是5型腺病毒载体、26型腺病毒载体或28型腺病毒载体。6.一种权利要求1
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5任一项所述的具有抗肿瘤免疫功能重组腺病毒的构建方法，其特征在于，具体为：人工合成编码融合蛋白CD137L
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【专利技术属性】
技术研发人员：高孟，吴洁，朱赟，沈钱通，张柯欣，安彤，李思奇，陈刚，庄昉成，陆绍红，
申请(专利权)人：杭州医学院，
类型：发明
国别省市：