一种独特基因缺失组合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术和病毒学技术领域，具体涉及一种独特基因缺失组合的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其应用。该四基因缺失株是通过缺失伪狂犬病病毒的gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因后得到的，具体是先制备PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通过同源重组技术、Cre

【技术实现步骤摘要】
一种独特基因缺失组合的PRV
Δ
gE/TK/UL56/US3四基因缺失株及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术和病毒学
，具体涉及采用同源重组技术、Cre
‑
LoxP系统构建PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，还涉及该基因缺失毒株在防控猪伪狂犬病中作为疫苗的应用。

技术介绍

[0002]伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alpha Herpesririnae)。猪是其自然宿主，可引起妊娠母猪流产、种猪不育、新生仔猪腹泻和神经系统症状。机体耐过PRV急性感染后，其病毒颗粒可在宿主三叉神经节建立长期潜伏感染而终身带毒。当受到外界应激或刺激时，体内潜伏的病毒粒子可重新被激活，造成复发性感染。该病目前尚无有效的药物可以进行治疗，疫苗免疫接种仍是预防和控制该病发生和流行的主要措施。随着PRV基因缺失疫苗(Bartha
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K61)的引入接种使用加上科学严格的规模化养殖，使得该病在一定程度上得以控制。
[0003]PRV基因组是双链线性DNA，约143kb，含有70个开放阅读框，具有很强的遗传稳定性。GC含量高达70％以上，是疱疹病毒中GC含量最高的。基因组由一个长的独特区域(UL)、一个短的独特区域(US)及位于US两侧的内部重复序列(IRS)、末端重复序列(TRL)组成。病毒基因组至少包括70个基因，可以编码70至100种病毒蛋白，其中多数基因是病毒复制非必需的。病毒增殖必需的糖蛋白主要有gL、gD、gB、gK、gH；非必需糖蛋白主要包括gG、gE、gC、gI、gM和gN等。PRV毒力受多个基因编码蛋白的影响，如gE、gC、gI、gD、gB、gH、TK、PK及RR等，缺失这些基因可以显著降低PRV毒力。
[0004]随着分子生物学的发展，对PRV基因组研究不断的深入，更进一步了解基因组结构对病毒生物学性质和免疫原性的影响，第二代弱毒活疫苗
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基因缺失疫苗应运而生。猪伪狂犬基因缺失疫苗其优势主要表现在：基因缺失疫苗稳定，不易发生毒力返祖增强；PRV基因缺失株毒力低，免疫原性强，保护时间长；可用于疫苗免疫动物与自然感染动物的鉴别诊断。
[0005]公开号为CN 110699329 A的中国专利技术专利申请，公开了基因缺失的减毒伪狂犬病病毒，其是通过基因工程手段将原始毒株的Us3基因序列，以及任选的包含Us区域的其他基因、gE、gI、和/或TK基因缺失以制备基因缺失减毒伪狂犬病病毒。该专利申请并未涉及UL56基因的缺失。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过缺失伪狂犬病病毒的gE、TK、UL56和US3基因，制备了一种免疫效力更强、安全性更高的新型基因缺失疫苗株PRVΔgE/TK/UL56/US3，进而有效防控和根除伪狂犬病。
[0007]本专利技术的猪伪狂犬病病毒基因缺失株，是通过缺失伪狂犬病病毒的gE基因、TK基
因、UL56基因和US3基因后得到的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株。
[0008]具体的，本专利技术的PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，是先制备PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株，然后通过同源重组技术、Cre
‑
LoxP系统，在PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的基础上缺失毒力基因US3，获得PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株，其制备方法具体包括以下步骤：
[0009](1)PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的构建：
[0010]转移载体pSK
‑
UL56
‑
LR
‑
EGFP构建：扩增PRV UL56基因左右侧基因序列作为同源重组的UL56基因左右侧同源臂，扩增EGFP荧光蛋白序列作为标记基因，将UL56基因左右侧同源臂和EGFP荧光蛋白序列分别经双酶切至线性片段，依次插入同样双酶切处理的线性载体pBluescript SK(
‑
)内，获得转移载体命名为pSK
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UL56
‑
LR
‑
EGFP；
[0011]重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
的获得以及荧光标签的剔除：采用脂质体转染法将重组质粒pSK
‑
UL56
‑
LR
‑
EGFP和PRVΔgE/TK基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
；随后将pcGlobin2
‑
Cre质粒和PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE/TK/UL56。
[0012]其中，所述PRVΔgE/TK的构建包括以下步骤：
[0013]①
重组病毒PRVΔgE的构建：
[0014]转移载体pSK
‑
gE
‑
LR
‑
EGFP构建：扩增PRV gE基因左右侧基因序列作为同源重组的gE基因左右侧同源臂，扩增EGFP荧光蛋白序列作为标记基因，将gE基因左右侧同源臂和EGFP荧光蛋白序列分别经双酶切至线性片段，依次插入同样双酶切处理的线性载体pBluescript SK(
‑
)内，获得转移载体命名为pSK
‑
gE
‑
LR
‑
EGFP；
[0015]重组病毒PRVΔgE/EGFP
+
的获得以及荧光标签的剔除：采用脂质体转染法将重组质粒pSK
‑
gE
‑
LR
‑
EGFP和PRV QYY2012株基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE/EGFP
+
；随后将pcGlobin2
‑
Cre质粒和PRVΔgE/EGFP
+
基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE；
[0016]②
重组病毒PRVΔgE/TK的构建：
[0017]转移载体pSK
‑
TK
‑
LR
‑
EGFP构建：扩增PRV TK基因左右侧基因序列作为同源重组的TK基因左右侧同源臂，扩增EGFP荧光蛋白序列作为标记基因，将TK基因左右侧同源臂和EGFP荧光蛋白序列分别经双酶切至线性片段，依次插入同样双酶切处理的线性载体pBluescript SK(
‑
)内，获得转移载体命名为pSK
‑
TK
‑
LR
‑
EGFP；
[0018]重组病毒PRVΔgE/TK/EGFP
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株，其特征在于，所述基因缺失毒株为缺失了gE基因、TK基因、UL56基因和US3基因的四基因缺失株PRVΔgE/TK/UL56/US3。2.根据权利要求1所述的一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株，其特征在于，所述PRVΔgE/TK/UL56/US3的保藏编号为：CGMCC No.22936。3.权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)PRVΔgE/TK/UL56三基因缺失株的构建：转移载体pSK
‑
UL56
‑
LR
‑
EGFP构建：扩增PRV UL56基因左右侧基因序列作为同源重组的UL56基因左右侧同源臂，扩增EGFP荧光蛋白序列作为标记基因，将UL56基因左右侧同源臂和EGFP荧光蛋白序列分别经双酶切至线性片段，依次插入同样双酶切处理的线性载体pBluescript SK(
‑
)内，获得转移载体命名为pSK
‑
UL56
‑
LR
‑
EGFP；重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
的获得以及荧光标签的剔除：采用脂质体转染法将重组质粒pSK
‑
UL56
‑
LR
‑
EGFP和PRVΔgE/TK基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
；随后将pcGlobin2
‑
Cre质粒和PRVΔgE/TK/UL56/EGFP
+
基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得重组病毒PRVΔgE/TK/UL56；(2)PRVΔgE/TK/UL56/US3四基因缺失株的构建：转移载体pSK
‑
US3
‑
LR
‑
EGFP构建：扩增PRV US3基因左右侧基因序列作为同源重组的US3基因左右侧同源臂，扩增EGFP荧光蛋白序列作为标记基因，将US3基因左右侧同源臂和EGFP荧光蛋白序列分别经双酶切至线性片段，依次插入同样双酶切处理的线性载体pBluescript SK(
‑
)内，获得转移载体命名为pSK
‑
US3
‑
LR
‑
EGFP；重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP
+
的获得：采用脂质体转染法将重组质粒pSK
‑
US3
‑
LR
‑
EGFP和PRVΔgE/TK/UL56基因组共转染至293T细胞内，通过蚀斑筛选获得表达绿色荧光蛋白的重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP
+
；重组病毒PRVΔgE/TK/UL56/US3/EGFP
+
荧光标签的剔除：采用脂质体转染法和Cr...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈陆，邓梦梦，王永生，杜季梅，丁晨梦，杨霞，王新卫，高冬生，郭占达，王川庆，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：