一种蛋白质标记效果快速检测方法技术

本发明专利技术是一种蛋白质标记效果快速检测方法，通过SELEX技术，筛选出凝血酶两个独立结合位点的核酸适体，作为基于接近效应原理检测方法的研究对象；分别在核酸适体的末端设计了一段较短的互补碱基序列，在37℃时互补末端不能形成稳定的杂交，因而在聚合酶的作用下无法进行聚合反应；而当两个核酸适体探针同时与凝血酶的两个位点结合时，互补末端在凝血酶介导下相互接近，从而形成稳定的杂交，通过聚合酶的作用分别向末端进行聚合反应，通过检测反应产生的荧光信号强弱来快速判断蛋白质标记的效果。果。果。

【技术实现步骤摘要】
一种蛋白质标记效果快速检测方法


[0001]本专利技术涉及蛋白质标记
，具体涉及一种蛋白质标记效果快速检测方 法。

技术介绍

[0002]虽然显示出较高的特异性与灵敏度，但存在着反应体系复杂、探针设计合成 难度高或需要结合PCR技术放大信号等局限性；本专利技术以凝血酶作为目标蛋白， 发展了一种更为简单、灵敏的基于接近效应的蛋白质检测新方法；该方法简化了 核酸适体探针的设计，直接将凝血酶的两个核酸适体设计成具有末端互补碱基序 列的线性探针；当二者同时结合到凝血酶的两个识别位点时，探针末端互补部分 借助蛋白质介导下的接近效应形成稳定的杂交，从而可以在聚合酶作用下引发聚 合反应。

技术实现思路

[0003]针对上述现有技术存在的问题，本专利技术提供一种蛋白质标记效果快速检测方 法，随着SELEX技术的进一步发展，将会有更多的与蛋白质不同位点结合的核酸 适体被筛选出来；通过发展二步法SELEX技术，即第一步筛选出一个结合位点的 核酸适体后，在已筛选出的核酸适体的饱和浓度下进行第二步筛选，得到另一个 结合位点的核酸适体，并以凝血酶为目标蛋白质验证了该技术的可行性。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种蛋白质标记效果快 速检测方法，其特征在于，包括通过SELEX技术，筛选出凝血酶两个独立结合位 点的核酸适体，作为基于接近效应原理检测方法的研究对象；
[0005]分别在核酸适体的末端设计了一段较短的互补碱基序列，在37℃时互补末 端不能形成稳定的杂交，因而在聚合酶的作用下无法进行聚合反应；而当两个核 酸适体探针同时与凝血酶的两个位点结合时，互补末端在凝血酶介导下相互接近， 从而形成稳定的杂交，通过聚合酶的作用分别向末端进行聚合反应；
[0006]两条探针所结合的凝血酶量越多，则形成稳定杂交的探针对越多，聚合反应 的初速度也就越大，反之则越慢；凝血酶的量决定了形成稳定杂交的探针对的数 目，后者与聚合反应的初速度成正比；随着凝血酶浓度的增加，聚合反应的初速 度不断增加，表现为单位时间内双链DNA产物中嵌入的荧光染料所产生的荧光信 号增强；
[0007]利用双链嵌入型荧光染料SybrGreenⅠ指示聚合产物双链DNA的量，可以对 聚合反应初速度进行检测，从而得到凝血酶的浓度；
[0008]进一步的，所述核酸适体探针4个部分组成:凝血酶核酸适体序列、形成分 子内发夹结构的互补序列、一定长度的聚胸腺嘧啶及末端可形成两条链间互补的 碱基序列；在核酸适体探针“头部”设计形成的发夹结构，为探针结合在凝血酶 上并进行聚合反应提供了更为稳定的结构基。
[0009]综上，本专利技术提供一种蛋白质标记效果快速检测方法，随着SELEX技术的进 一步发展，将会有更多的与蛋白质不同位点结合的核酸适体被筛选出来；通过发 展二步法
SELEX技术，即第一步筛选出一个结合位点的核酸适体后，在已筛选出 的核酸适体的饱和浓度下进行第二步筛选，得到另一个结合位点的核酸适体，并 以凝血酶为目标蛋白质验证了该技术的可行性。
[0010]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例 或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的 附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造 性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
附图说明
[0011]图1是本专利技术的接近效应聚合反应检测凝血酶的原理图；
[0012]图2是本专利技术的核酸适体探针筛选结果图；
[0013]图3是本专利技术的定量检测凝血酶的结果图；
[0014]图4是本专利技术的方法特异性考察结果；
具体实施方式
[0015]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图对 本专利技术实施例做进一步详细说明。在此，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解 释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0016]本专利技术是通过SELEX技术，筛选出凝血酶两个独立结合位点的核酸适体，作 为基于接近效应原理检测方法的研究对象；如图1所示，分别在核酸适体的3
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末端设计了一段较短的互补碱基序列，在37℃时互补末端不能形成稳定的杂交， 因而在聚合酶的作用下无法进行聚合反应；而当两个核酸适体探针同时与凝血酶 的两个位点结合时，互补末端在凝血酶介导下相互接近，从而形成稳定的杂交， 通过聚合酶的作用分别向5
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端进行聚合反应；两条探针所结合的凝血酶量越多， 则形成稳定杂交的探针对越多，聚合反应的初速度也就越大，反之则越慢；凝血 酶的量决定了形成稳定杂交的探针对的数目，后者与聚合反应的初速度成正比； 随着凝血酶浓度的增加，聚合反应的初速度不断增加，表现为单位时间内双链 DNA产物中嵌入的荧光染料所产生的荧光信号增强；利用双链嵌入型荧光染料 SybrGreenⅠ指示聚合产物双链DNA的量，可以对聚合反应初速度进行检测，从 而得到凝血酶的浓度；
[0017]核酸适体探针由4个部分组成:凝血酶核酸适体序列(下划线部分)、形成分子内发夹结构 的互补序列(斜体部分)、一定长度的聚胸腺嘧啶及3
′
末端可形成两条链间互补的碱基序列 (黑体)；在核酸适体探针“头部”设计形成的发夹结构，为探针结合在凝血酶上并进行聚合 反应提供了更为稳定的结构基础[18，21]；聚胸腺嘧啶的增加可减少凝血酶对聚合反应可能 形成的空间位阻[17，18]；在凝血酶肝素位点结合的核酸适体探针(B1～B5)3
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末端分别设计 了4～8个互补碱基与凝血酶纤维蛋白原位点结合的核酸适体；
[0018]探针(A)3
′
末端互补；从筛选结果来看(如图2)，两条探针末端有7或8个 碱基互补的时候，聚合反应可以在37℃下以一定的速度进行，凝血酶的加入可 加快聚合反应的速度，但检测时本底过高；当互补碱基为4或5个时，无论是否 存在凝血酶，均观察不到聚合反应的进行[22]；两条探针末端的互补碱基对数目 为6时，在37℃时不能形成稳定的结合，聚
合反应也很慢；而当加入凝血酶后， 核酸适体探针同时与凝血酶的两个位点结合，使得互补末端形成的杂交稳定性提 高，在聚合酶的作用下以一定的速度发生聚合；所以选择末端为6个碱基互补的 探针对用于凝血酶的定量检测；
[0019]考察了凝血酶浓度与聚合反应初速度的定量关系(图3)；结果表明，凝血酶 浓度在10pmol/L～1nmol/L范围时，与聚合反应初速度之间有良好的线性关系 (R2＝0；996)，检测下限达到6；9pmol/L；但随着凝血酶浓度的继续提高，聚合 反应初速度的上升减缓；而当凝血酶浓度超过5nmol/L以后，聚合反应初速度反 而呈下降趋势；这主要是因为当凝血酶的浓度较高时，探针对同时结合到同一个 凝血酶分子上的几率减小，借助接近效应形成的稳定互补末端的量也会减少，表 现为聚合反应初速度的降低；
[0020]分别选择3种对照蛋白考察了方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蛋白质标记效果快速检测方法，其特征在于，包括通过SELEX技术，筛选出凝血酶两个独立结合位点的核酸适体，作为基于接近效应原理检测方法的研究对象；分别在核酸适体的末端设计了一段较短的互补碱基序列，在37℃时互补末端不能形成稳定的杂交，因而在聚合酶的作用下无法进行聚合反应；而当两个核酸适体探针同时与凝血酶的两个位点结合时，互补末端在凝血酶介导下相互接近，从而形成稳定的杂交，通过聚合酶的作用分别向末端进行聚合反应；两条探针所结合的凝血酶量越多，则形成稳定杂交的探针对越多，聚合反应的初速度也就越大，反之则越慢；凝血酶的量决定了形成稳定杂交的探针对的数目，后者与聚合反...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪斌，李俊峰，余澹台，陈耀真，
申请(专利权)人：湖北普罗金科技有限公司，
类型：发明
国别省市：