糖原磷酸化酶基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针及其制备方法，该探针的序列如序列1所示。本发明专利技术对活体动物建立模型后进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中糖原磷酸化酶(脑型)基因的mRNA发生特异性的结合，从而方便、准确的观察到组织中糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA水平的变化。本发明专利技术使用的糖原磷酸化酶(脑型)的探针序列，对糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA的显示有明确的特异性，实现了对糖原磷酸化酶(脑型)基因mRNA水平的显示作用。显示作用。显示作用。

【技术实现步骤摘要】
糖原磷酸化酶基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医学领域，涉及一种探针及其设计方法，尤其涉及一种糖原磷酸化酶基因的cRNA原位杂交探针及其制备方法。

技术介绍

[0002]越来越多的实验证据支持糖、脂、氨基酸和神经营养因子代谢异常在抑郁症的发生发展中发挥着重要作用。以往糖原代谢研究主要关注于肝脏和肌肉组织，脑糖原的研究较少，与脑糖原相关的疾病研究更加有限。在糖原分解代谢过程中起着重要作用的酶是糖原磷酸化酶。糖原磷酸化酶是糖原分解途径中最重要的关键酶，是一种大分子蛋白聚合体，具备多个功能结构域，包括催化域、糖原结合域和变构域等，主要在脑组织和胎盘中表达。糖原磷酸化酶在应激状态下，能够快速催化分解糖原，为脑组织提供短暂的能量供应。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针及其制备方法。
[0004]本专利技术的目的是通过以下技术方案来解决的：
[0005]本专利技术的一个方面，公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针，该探针的序列如序列1所示。
[0006]本专利技术的第二个方面，公开了一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针的制备方法，具体步骤包括：
[0007](1)根据糖原磷酸化酶(脑型)的Gene bank序列设计了糖原磷酸化酶(脑型)特异的引物，并且此对引物扩增出937bp的糖原磷酸化酶(脑型)片段作为糖原磷酸化酶(脑型)特异的探针序列；
[0008](2)构建糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；
[0009](3)制备糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA原位杂交探针；
[0010](4)检测糖原磷酸化酶(脑型)的cRNA探针的原位杂交。
[0011]进一步地，步骤(1)中糖原磷酸化酶(脑型)特异的引物是：
[0012]上游引物：5
′
ATGGTCCCCACAGCTTCA 3
′
；
[0013]下游引物：5
′
GGCTTCAGGGGACCTCAT 3
′
。
[0014]进一步地，步骤(2)按照如下步骤进行：
[0015](a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增；
[0016](b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；
[0017](c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接；
[0018](d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。
[0019]进一步地，步骤(3)按照如下步骤进行：
[0020](a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认糖原磷酸化酶(脑型)探针序列插
入载体的顺序是正向的；
[0021](b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切；
[0022](c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；
[0023](d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。
[0024]进一步地，步骤(4)按照如下步骤进行：
[0025](a)将大鼠用0.4％戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.01mol/L的DEPC
‑
PBS的快速冲洗去除血液，再以4％多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L DEPC
‑
PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1％的DEPC 1ml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4％的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml；所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠，2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成；
[0026](b)取材后进行脑组织的后固定：于4℃，用4％的多聚甲醛后固定24小时；
[0027](c)将固定好的组织进行切片：将组织切成25～30μm组织切片，并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC
‑
PBS中，放于4℃冰箱备用；
[0028](d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC
‑
PBS清洗1次，室温，每次5
‑
10分钟；
[0029](e)将上述(d)清洗过的片子用5xSSC清洗2次，室温，每次5
‑
10分钟；所述5xSSC是由20xSSC用超纯水稀释的，20xSSC为一种柠檬酸缓冲液；
[0030](f)将5xSSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55℃，在杂交炉孵育1
‑
2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺，2.5ml的20xSSC溶液，200μl的50xDenhardt
’
s溶液，50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液，100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液，100μl的浓度为10％的CHAPS溶液，100μl的浓度为10％的Tween
‑
20溶液，100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC
‑
H2O混合配制而成；所述50xDenhardt
’
s为一种常用的杂交试剂；所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC
‑
H2O中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC
‑
H2O中配制而成；所述10％的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC
‑
H2O中配制而成；所述10％的Tween
‑
20为100μl的Tween
‑
20溶于900μl的DEPC
‑
H2O中配制而成；所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC
‑
H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用；所述DEPC
‑
H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1％的DEPC 1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水；
[0031](g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55℃，在杂交炉中孵育16
‑
20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0ug/ml的cRNA探针配置成的；
[0032](h)杂交后用1xSSC洗涤杂交的组织切片，37℃，2次，每次10分钟；
[0033](i)用2xSSC洗涤上述的组织切片，37℃，2次，每次10
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针，其特征在于，所述探针的序列如序列1所示。2.一种糖原磷酸化酶基因cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：(1)根据糖原磷酸化酶的Gene bank序列设计了糖原磷酸化酶特异的引物，并且此对引物扩增出937bp的糖原磷酸化酶片段作为糖原磷酸化酶特异的探针序列；(2)构建糖原磷酸化酶的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备糖原磷酸化酶的cRNA原位杂交探针；(4)检测糖原磷酸化酶的cRNA探针的原位杂交。3.根据权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中糖原磷酸化酶特异的引物是：上游引物：5
′
ATGGTCCCCACAGCTTCA 3
′
；下游引物：5
′
GGCTTCAGGGGACCTCAT 3
′
。4.根据权利要求3所述的根据权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)按照如下步骤进行：(a)将大鼠的cDNA用设计的引物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子的载体进行连接；(d)将连接好的质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序。5.根据权利要求4所述的根据权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)按照如下步骤进行：(a)步骤(2)的到的细菌测序正确后，经判断确认糖原磷酸化酶(脑型)探针序列插入载体的顺序是正向的；(b)需要使用BamH I限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用SP6 RNA聚合酶对探针进行体外转录标记。6.根据权利要求5所述的根据权利要求1所述的探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)按照如下步骤进行：(a)将大鼠用0.4％戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.01mol/L的DEPC
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PBS的快速冲洗去除血液，再以4％多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L DEPC
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PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1％的DEPC 1ml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4％的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml；所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠，2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成；(b)取材后进行脑组织的后固定：于4℃，用4％的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片：将组织切成25～30μm组织切片，并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC
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PBS中，放于4℃冰箱备用；(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC
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PBS清洗1次，室温，每次5
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10分钟；
(e)将上述(d)清洗过的片子用5x SSC清洗2次，室温，每次5
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10分钟；所述5x SSC是由20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种柠檬酸缓冲液；(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55℃，在杂交炉孵育1
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【专利技术属性】
技术研发人员：朱媛媛，黄静，武胜昔，李嘉琪，樊泽，李玉骞，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：