一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用。该方法包括步骤01、构建酿酒酵母yG010；步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011；步骤03、替换酿酒酵母yG011基因组中MvaE的表达启动子。本发明专利技术通过调控酵母细胞内源脂肪酸合成酶FASI的表达水平及内源甲羟戊酸合成通路(MVA)中MvaE酶的表达水平来解决合成路径中对前体乙酰辅酶A不均衡竞争及分配的问题，达到高产大麻萜酚酸的目的。高产大麻萜酚酸的目的。高产大麻萜酚酸的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及合成生物学
基因工程改造技术，更具体地，本专利技术涉及在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。

技术介绍

[0002]大麻二酚酸 CBGA 是合成物中的重要前体化合物，其从头生物合成途径如附图 1 所示。
[0003]在合成大麻二酚酸 CBGA 的途径中，三条中间产物的合成路径同时利用前体乙酰辅酶 A（如附图 1 所示）。由于对乙酰辅酶 A 的竞争能力不同导致了乙酰辅酶 A 在三条通路中的不平衡分配结果，进而影响到终产物 CBGA 的合成。
[0004]因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本专利技术提供了一种在酿酒酵母中通过甲羟戊酸合成通路中酶 MvaE 及内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平构建的高产大麻二酚酸的菌株构建方法和应用。
[0006]本专利技术为达到上述目的所采用的技术方案是：一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，所述方法包括：步骤 01、构建酿酒酵母 yG010，在高产大麻萜酚酸菌株 yG003 基因组中采用pTDH3 启动子表OAC 基因；步骤 02、替换酿酒酵母 yG010 基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI 的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。
[0007]在一些实施例中，所述方法包括：步骤 03、以重组酿酒酵母 yG011 的基因组为模板，替换基因组中的 MvaE 酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
[0008]在一些实施例中，所述步骤 02 包括：步骤 21、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 FAS1
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Up 片段；步骤 22、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 FAS1
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Down 片段；步骤 23、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXT1片段；
步骤 24、将 FAS1
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Up 、pHXT1、FAS1
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Down 作为插入片段转化至酿酒酵母yG010 中，获得调控FASI 表达水平的重组酿酒酵母 yG011。
[0009]在一些实施例中，所述步骤 03 包括：步骤 31、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE
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Up 片段；步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE
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Down 片段；步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1等启动子片段；步骤 34、将 MvaE
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Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE
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Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。
[0010]在一些实施例中，所述步骤 03 包括：步骤 31、以初始酿酒酵母yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到上游同源臂 MvaE
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Up 片段；步骤 32、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到下游同源臂 MvaE
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Down 片段；步骤 33、以初始酿酒酵母 yG010 的基因组为模板，通过 PCR 扩增得到 pHXK1等启动子片段；步骤 33、MvaE
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Up、pHXK1 等启动子片段、MvaE
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Down 作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控 MvaE 表达水平的系列重组酿酒酵母 yG012、yG013、yG014、yG015、yG016、yG017、yG018。
[0011]在一些实施例中，所述的调控 FASI 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始 OD 值为 0.2，培养 4
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4.5 h，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O 混合而成；插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
[0012]在一些实施例中，所述调控 MvaE 表达水平的重组酿酒酵母的构建方法中，转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350 法；所述醋酸锂/PEG3350 法的步骤包括：将酿酒酵母接种到 1xYPD 培养基中使起始 OD 值为 0.2，培养 4
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4.5 h，收集细胞，根据构建菌株数，通过离心、洗涤后收集细胞；插入片段的用量为：每 5 OD 酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用 50μL DNA 混合物悬浮该细胞，50μL DNA 混合物由 2μg 所述插入片段、250 ng 工具质粒以及足量 ddH2O 混合而成；插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，
获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
[0013]本专利技术公开了一种优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母，所述重组酿酒酵母通过上述的构建方法构建而成。
[0014]本专利技术还公开了一种重组酿酒酵母在产大麻萜酚酸中的应用。
[0015]本专利技术的有益效果是：本专利技术通过调控酵母细胞内源脂肪酸合成酶 FASI 的表达水平及内源甲羟戊酸合成通路（MVA）中 MvaE 酶的表达水平来解决合成物路径中对前体乙酰辅酶 A 不均衡竞争及分配的问题，达到高产大麻萜酚酸的目的。
附图说明
[0016]图 1 为大麻萜酚酸在酿酒酵母中的合成途径；图 2 为替换 FAS1 启动子菌株 yG010 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸 CBGA 产率比较；图 3 为替换 FAS1 启菌株 yG011 基础上 MvaE 启动子替换菌株的大麻二酚酸CBGA 产率比较。
具体实施方式
[0017]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加浅显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：步骤01、构建酿酒酵母yG010，在高产大麻萜酚酸菌株yG003基因组中采用pTDH3启动子表OAC基因；步骤02、替换酿酒酵母yG010基因组中的内源脂肪酸合成酶FASI的启动子，得到重组酿酒酵母yG011。2.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于，所述方法包括：步骤03、以重组酿酒酵母yG011的基因组为模板，替换基因组中的MvaE酶的启动子，得到系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。3.根据权利要求1所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：步骤21、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂FAS1
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Up片段；步骤22、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂FAS1
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Down片段；步骤23、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXT1片段；步骤24、将FAS1
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Up、pHXT1、FAS1
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Down作为插入片段转化至酿酒酵母yG010中，获得调控FASI表达水平的重组酿酒酵母yG011。4.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE
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Up片段；步骤32、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂MvaE
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Down片段；步骤33、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到pHXK1等启动子片段；步骤34、将MvaE
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Up、pHXK1等启动子片段、MvaE
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Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得调控MvaE表达水平的系列重组酿酒酵母yG022、yG023、yG024、yG025、yG026、yG027、yG028。5.根据权利要求2所述的优化代谢流产大麻萜酚酸的酵母的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：步骤31、以初始酿酒酵母yG010的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂MvaE
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【专利技术属性】
技术研发人员：张云丰，罗小舟，
申请(专利权)人：森瑞斯生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：