一种rhG-CSF的发酵培养基及其发酵方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵技术领域，特别涉及rhG

【技术实现步骤摘要】
一种rhG
‑
CSF的发酵培养基及其发酵方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种rhG
‑
CSF的发酵培养基及其发酵方法。

技术介绍

[0002]粒细胞集落剌激因子(granulocyte colony
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stimulating factor,G
‑
CSF)具有促进粒系造血 干细胞增殖分化及增强成熟粒细胞功能的作用，对于骨髓移植时促进中性白细胞增加、癌 症化疗时引起的严重中性粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均 有明显疗效。其早期临床适应症为癌症化疗及骨髓移植后的中性粒细胞减少，以后逐步扩 大到各种病因引起的中性粒细胞减少症。
[0003]高密度发酵技术可以提高菌体的发酵密度，提高产物的比生产率，其不但可相应减少 发酵规模和生产批次，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，从而大大 提高产品竞争力。大肠杆菌的遗传背景研究比较透彻，加之其容易培养，生长速度快，表 达载体丰富、大规模培养工艺成熟、表达量高等特点，使其成为应用最广泛的基因工程合 成异源蛋白的原核表达系统。
[0004]然而，外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系， 而且与其所处的环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需 要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。
[0005]基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。菌 株的高密度生长将导致供氧不足和培养基中大量乙酸的产生，这将极大的影响菌体的生长； 另外，菌体密度的高低与外源蛋白表达量之间并没有相关性，他们之间的结合点就是诱导 条件的确定。
[0006]基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的 基因产物及产量。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因 表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工 程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工 程菌的质粒稳定性，目前考察高密度培养过程质粒稳定性的文献并不多。
[0007]合适的诱导剂种类和浓度选择是基因工程菌成功表达的关键。异丙基
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β
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D
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硫代半乳糖 苷(IPTG)毒性较大、成本较高，而乳糖作为二糖，无毒、价廉，本身可以作为碳源使用， 是一种较佳的IPTG替代。而IPTG较乳糖等其他乳糖类似物诱导剂相比是最高效的诱导剂， 因此选用何种诱导剂需要进行实验验证。
[0008]乙酸是大肠杆菌发酵过程中主要的有害副产物，其积累对菌体的生长和产物的表达均 有明显的抑制作用。利用氧化还原状态不同的碳源可以明显影响微生物细胞内 NADH/NAD+的比及碳代谢流量分布。在微生物发酵中，以葡萄糖、山梨醇、葡萄糖酸盐 分别作为碳源时，山梨醇较葡萄糖能够产生较多的NADH，有一半葡萄糖酸盐则由于直接 转变为
丙酮酸而没有生成NADH。闫霞研究发现，与山梨醇为碳源的发酵相比，以葡萄糖 或木糖作为碳源时，更多的AcCoA流向乙酸，增强了乙酸合成与PSA合成竞争利用AcCoA；同时以葡萄糖或木糖为碳源时，菌体的生长受到影响，加上乙酸对工程菌的毒害作 用，使PSA的合成量较低。同时以山梨醇为碳源时，可能降低了能荷对丙酮酸激酶的抑制 作用，有利于菌体生长与PSA合成。徐志南等在培养大肠杆菌表达人表皮生长因子(hEGF) 时，利用葡萄糖代替酸液，在pH值升高时不再加酸而是自动加入葡萄糖液来调节，但调 节时有一定的滞后，未能避免糖浓度的波动和代谢副产物的积累。rhG
‑
CSF工程菌在发酵 过程中也存在同样的问题，产生乙酸等副产物过多，会抑制细菌生长，最终导致发酵密度 偏低，发酵产量不高。目前重组大肠杆菌发酵通常在基础培养基中初始就加入葡萄糖，补 料的方法一般是控制补料速度，减少乙酸的产生。在实际发酵过程中该方法仍然效果不佳， 工程菌初始生长速率过快不受控，发酵水平得不到显著提高。

技术实现思路

[0009]鉴于目前发酵生产rhG
‑
CSF的效率不高的现状，本专利技术提供一种以山梨醇或甘露醇作 为碳源，利用补加培养基方式，从而提高发酵生产rhG
‑
CSF产量的方法。
[0010]本专利技术的第一个方面提供一种用于生产rhG
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CSF的基础培养基，所述基础培养基包括 碳源、酵母提取物、胰蛋白胨、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵、氯化钠、硫酸亚铁、 硫酸镁和消泡剂，其中，碳源需要单独配制并灭菌。
[0011]优选地，所述碳源为山梨醇或甘露醇中的一种或组合。
[0012]在一个优选实施方案中，所述基础培养基包括碳源100ml/L，酵母提取物1
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5g/L，胰 蛋白胨2
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10g/L，十二水合磷酸氢二钠20
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40g/L，磷酸二氢钾2
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10g/L，氯化铵2
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10g/L， 氯化钠0.5
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3g/L，硫酸亚铁0.01
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0.03g/L,硫酸镁0.5
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2g/L，消泡剂0.2
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1ml/L，其中，碳源 浓度为200
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600g/L，单独配制并灭菌。
[0013]在一个优选实施方案中，所述基础培养基包括碳源100ml/L，酵母提取物2
‑
3g/L,胰蛋 白胨4
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7g/L，十二水合磷酸氢二钠25
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35g/L，磷酸二氢钾4
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7g/L，氯化铵4
‑
7g/L，氯化 钠1
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2g/L，硫酸亚铁0.01
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0.02g/L，硫酸镁0.5
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1g/L，消泡剂0.3
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0.5ml/L，其中，碳源浓 度为300
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500g/L，单独配制并灭菌。。
[0014]本专利技术的第二个方面提供用于生产rhG
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CSF的补料培养基，所述补料培养基包括山梨 醇，甘露醇，乳糖，酵母提取物，胰蛋白胨，硫酸镁中的一种或组合。
[0015]在一个优选实施方案中，所述补料培养基包括补料培养基1和补料培养基2。
[0016]在一个优选实施方案中，所述补料培养基1包括山梨醇或甘露醇400
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600g/L，酵母提 取物35
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55g/L，胰蛋白胨45
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75g/L，硫酸镁0.5
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3g/L。补料培养基2包括山梨醇或甘露醇 200
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300g/L，乳糖200
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300g/L，胰蛋白胨45
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产rhG
‑
CSF的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基中包含如下所示的组分：碳源、酵母提取物、胰蛋白胨、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁和消泡剂。2.根据权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述碳源为山梨醇或甘露醇中的一种或组合。3.根据权利要求1所述的基础培养基，其特征在于，所述基础培养基中包含如下所示的组分：其中，碳源浓度为200
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600g/L，碳源需要单独配制。4.一种用于生产rhG
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CSF的发酵方法，其特征在于，具体技术方案如下：I.将工程菌菌种在种子培养基中逐级放大，获得种子液；II.将种子液接种至权利要求1所述基础培养基中进行高密度培养，流加碳源，分批次流加补料培养基至培养结束。5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述工程菌菌种为p
ET
‑
G
‑
CSF
/BL
21
(DE3)PlysS。6.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，流加碳源是在步骤II开始培养2
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4h后流加至发酵体系中，并控制2
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4h流加完毕。7.根据权利要求4所述的发酵方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贵民，冀成法，马鲁南，刘忠，
申请(专利权)人：山东新时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：