一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法技术

本发明专利技术公开了一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法，所述方法包括以下步骤(1)、脐橙园AM真菌调查，决定脐橙园AM真菌调控策略；(2)、利用AM真菌

【技术实现步骤摘要】
一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法


[0001]本专利技术涉及环境治理
，具体涉及一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减 方法。

技术介绍

[0002]磷素的污染下限是氮素的十分之一，因此，磷素是水体富营养化的主要限制因子，且磷 素流失相对容易控制。如果能控制住磷素向水体迁移，便能遏制水体富营养化问题。江西省 水果栽植历史悠久，果树栽培在在种植业中仅次于水稻，是我省提升农业经济效益和精准扶 贫的重要方向。我省的水果产业以亚热带水果为主，其中赣南脐橙、南丰蜜桔、奉新猕猴桃、 信丰甜柚等水果品牌闻名全国。但是，南方红壤区旱地土壤普遍缺磷，其中总磷含量严重缺 乏(<0.04g/kg)的面积达到28.5％，有效磷严重缺乏(<5mg/kg)的面积高达77.8％。因此， 果农在建园初期，大量施用磷肥。但由于磷肥的当季利用率仅有10％
‑
15％，且地表覆盖度不 够，过剩磷肥易随泥沙迁移至水体，造成面源污染。因此，消减果园建园初期磷素流失是控 制南方果园面源污染的重中之重。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的问题是：提供一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法，能够 为脐橙园生态提升和清洁生产提供有效解决方案。
[0004]本专利技术为解决上述问题所提供的技术方案为：一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染 消减方法，所述方法包括以下步骤
[0005](1)、脐橙园AM真菌调查，决定脐橙园AM真菌调控策略；
[0006](2)、利用AM真菌
‑
植物联合实现脐橙园台面和梯壁，减少源头磷素流失；
[0007](3)、基于AM真菌在草沟磷素流失中的关键作用，优化脐橙园杀菌剂施用方法，强化 过程拦截磷素。
[0008]优选的，所述步骤(1)具体包括
[0009](1.1)、样品采集：
[0010]在脐橙园内选择相距200m的三个台面，每个台面选择3棵脐橙树；在距离每棵树50cm 处通过五点采样法收集30cm以上表土，混合后作为一个样品；通过冰盒运输至实验室，过 2mm筛掉根系和砾石后，置于
‑
80℃冰箱保存；
[0011](1.2)、总DNA的提取与检测：
[0012]利用试剂盒提取土壤总DNA，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断，利用紫外 分光光度计对DNA进行定量；样品质量是否合格以后续PCR是否能够扩增出有效目的条带 为准；
[0013](1.3)、DNA扩增：
[0014]将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于98℃预变性30s，使模板DNA充分 变性，然后进入扩增循环；在每一个循环中，先于98℃保持15s钟使模板变性，然后将温 度降
到50℃，保持30s，使引物与模板充分退火；在72℃保持30s，使引物在模板上延伸， 合成DNA，完成一个循环；重复这样的循环25
‑
27次，使扩增的DNA片段大量累积；最后， 在72℃保持5min，使产物延伸完整，4℃保存；
[0015](1.4)、建库；
[0016](1.5)、文库质检与测序。
[0017]优选的，所述步骤(1.4)具体包括
[0018](1.4.1)、利用试剂盒中的End Repair Mix2将DNA 5
’
端突出的碱基切除，3
’
端缺失的 碱基补齐，同时在5
’
端加上一个磷酸基团，具体步骤如下：
[0019]a.取30ng混好的DNA片段补水至60μL，加入40μL End Repair Mix2；
[0020]b.用枪吹打混匀，并置于PCR仪上30℃孵育30min；
[0021]c.利用BECKMAN AMPure XP beads纯化末端修复体系，最终用17.5μL Resuspension buffer洗脱；
[0022](1.4.2)、3
’
端加A，在这一过程中，DNA的3
’
端会单独加上一个A碱基，具体步骤 如下：
[0023]a.向片段选择后的DNA中加入12.5μL A
‑
Tailing Mix；
[0024]b.用枪吹打混匀，并置于PCR仪上孵育，程序如下：37℃，30min；70℃，5min；4℃， 5min；4℃，∞；
[0025](1.4.3)、加一个有特异性标签的接头，此过程是为了让DNA最终杂交到Flow Cell上， 具体步骤如下：
[0026]a.在已加A的体系中，加入2.5μL Resuspension buffer，2.5μL Ligation Mix和2.5μL DNA adapter Index；
[0027]b.用枪吹打混匀，并置于PCR仪上，30℃孵育10min；
[0028]c.加入5μLStopLigationbuffer；
[0029]d.利用BECKMAN AMPure XP beads纯化已加接头的体系；
[0030](1.4.4)、通过PCR扩增已经加上接头的DNA片段，然后利用BECKMAN AMPure XP beads纯化PCR体系；
[0031](1.4.5)、通过2％琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化。
[0032]优选的，所述步骤(1.5)具体包括
[0033](1.5.1)、文库质检与定量
[0034]取1μL文库，在Agilent Bioanalyzer机器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库 做2100质检，利用Quant
‑
iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上对文库进 行定量，合格的文库计算后浓度应在2nM以上；
[0035](1.5.2)、测序
[0036]对合格的文库，在MiSeq机器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)进行2
×
250bp的 双端测序；首先将需要上机的文库梯度稀释到2nM，然后按所需数据量比例混样；混好的文 库经0.1N NaOH变性成单链进行上机测序；
[0037](1.5.3)、序列注释
[0038]去掉barcode和引物后，利用FLASH、QIIME或者MOTHUR获得有效数据，用DADA2 软件划分ASV并选取代表序列，同时与真菌ITS数据库Unite_8比对注释ASV代表序列。
[0039]优选的，所述步骤(2)具体包括将菌剂均匀铺在脐橙园台面和梯壁土壤表层，种子用 75％酒精2min消毒，然后用蒸馏水冲洗后再播种。
[0040]优选的，所述步骤(3)具体包括在脐橙园内开设草沟，在草沟内种植草本植物，并接种 AM真菌。
[0041]与现有技术相比，本专利技术的优点是：本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤(1)、脐橙园AM真菌调查，决定脐橙园AM真菌调控策略；(2)、利用AM真菌
‑
植物联合实现脐橙园台面和梯壁，减少源头磷素流失；(3)、基于AM真菌在草沟磷素流失中的关键作用，优化脐橙园杀菌剂施用方法，强化过程拦截磷素。2.根据权利要求1所述的一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法，其特征在于：所述步骤(1)具体包括(1.1)、样品采集：在脐橙园内选择相距200m的三个台面，每个台面选择3棵脐橙树；在距离每棵树50cm处通过五点采样法收集30cm以上表土，混合后作为一个样品；通过冰盒运输至实验室，过2mm筛掉根系和砾石后，置于
‑
80℃冰箱保存；(1.2)、总DNA的提取与检测：利用试剂盒提取土壤总DNA，进行0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分子大小判断，利用紫外分光光度计对DNA进行定量；样品质量是否合格以后续PCR能否扩增出有效目的条带为准；(1.3)、DNA扩增：将PCR反应所需的成分配置完后，在PCR仪上于98℃预变性30s，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；在每一个循环中，先于98℃保持15s钟使模板变性，然后将温度降到50℃，保持30s，使引物与模板充分退火；在72℃保持30s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环；重复这样的循环25
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27次，使扩增的DNA片段大量累积；最后，在72℃保持5min，使产物延伸完整，4℃保存；(1.4)、建库；(1.5)、文库质检与测序。3.根据权利要求2所述的一种基于AM真菌的脐橙园磷素面源污染消减方法，其特征在于：所述步骤(1.4)具体包括(1.4.1)、利用试剂盒中的End Repair Mix2将DNA 5
’
端突出的碱基切除，3
’
端缺失的碱基补齐，同时在5
’
端加上一个磷酸基团，具体步骤如下：a.取30ng混好的DNA片段补水至60μL，加入40μL End Repair Mix2；b.用枪吹打混匀，并置于PCR仪上30℃孵育30min；c.利用BECKMAN AMPure XP beads纯化末端修复体系，最终用17.5μL Resuspension buffer洗脱；(1.4.2)、3
’
端加A，在这一过程中，DNA的3
’
端会单独加上一个A碱基，具体步骤如下：a.向片段选择后的DNA中加入12.5μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洪光，孔召玉，张利超，
申请(专利权)人：江西省水利科学院，
类型：发明
国别省市：