上游调控因子IbWRKY1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用制造技术

本发明专利技术公开了上游调控因子IbWRKY1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用。本发明专利技术以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbMYB1的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbMYB1基因的上游调控因子IbWRKY1。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbMYB1启动子与上游调控因子IbWRKY1之间存在相互作用。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验，研究了调控因子之间的相互作用，结果显示，IbWRKY1与IbEBF2存在相互作用。本发明专利技术在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。索。索。

【技术实现步骤摘要】
上游调控因子IbWRKY1及其在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用


[0001]本专利技术涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及上游调控因子IbWRKY1及其 在调控紫心甘薯IbMYB1表达中的应用。

技术介绍

[0002]甘薯是一种具有多种用途的根茎类农作物，尤其是在食品工业等方面的应用具有重大 意义。块根是甘薯的主要收获器官,在甘薯块根中含有大量的可溶性糖和蛋白质等营养成 分。甘薯块根可直接用作食品，也可用于酒精和淀粉生产以及动物饲料等各个方面。在一 些国家，甘薯被评价为健康的食品，因为它含有类胡萝卜素和花青素等具有抗氧化和其他 活性的功能成分。
[0003]花青素相关的结构基因的表达主要受到IbMYB1基因启动子的调控。已有学者研究发 现IbMYB1受到光、激素等环境因子的调控，但由于甘薯块根是深埋于地下的不见光部分。 IbMYB1启动子可能受到其它还未发现的基因对它的调控，从而参与花青素的合成途径。研 究发现，在心里美萝卜中，RsMYB1启动子上游存在7372bp的CACTA类型转座子，其在 心里美萝卜肉色形成中发挥重要作用，同时高度甲基化的转座子扩散到RsMYB1启动子区 域，使该基因的表达受到抑制，阻断花青苷的合成，形成白肉突变体。通过酵母双杂等实 验证实，MdMYB1与MdSIZ1相互作用,在愈伤和苹果果实中MdSIZ1通过SUMO化MYB1 调控花青苷的合成。由此可见，MYB1启动子通过与某些蛋白相互作用，调控花青素的合 成，因此寻找MYB1启动子在花青素合成途径中的互作蛋白具有重大意义。
[0004]WRKY基因家族是高等植物转录因子家族中一个大家族，在植物生理过程和环境适应 的转录调节中起重要作用。基于WRKY结构域的数量和锌指位点的具体特征，WRKY蛋白 分为三类，第一类是含有两个WRKY结构域(分别在C段和N段)，其锌指位点为C2H2； 第二类和第三类都只含有1个WRKY结构域，第二类的锌指位点为C2H2，第三类的锌指 位点为C2HC，同时第二类WRKY蛋白根据附加的短反结构位点的不同又分为五个亚类 (IIa、IIb、IIc、IId和IIe)。在植物中，转录因子WRKY家族是一个大的转录调控家族， 主要调控植物的生长发育和抗生物和非生物胁迫，过表达WRKY可使植物的抗逆性增强。 有报道发现WRKY参与了花色素苷合成的调控，WRKY40参与了苹果中花色素苷合成的调 控，黄酮类物质的合成途径是高度有组织的，关键的结构基因和大量的转录因子一起参与 了其过程。到目前为止已有至少6类主要的转录因子参与其中，分别是MYB、bHLH、WD40、 WRKY、Zinc finger和MADS蛋白。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于筛选一种促进紫心甘薯IbMYB1表达的上游调控因子。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技 术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。
[0007]进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNA Polymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，并将启动子 IbMYB1构建到pAbAi载体中，扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序 列如下所示：
[0008]PIbMYB1
‑
F：5'
‑
TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA
‑
3'和
[0009]PIbMYB1
‑
R：5'
‑
TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA
‑
3'。
[0010]构建的pAbAi
‑
PIbMYB1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓 度为300ng/mL。
[0011]本专利技术其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi
‑
PIbMYB1 感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbMYB1 基因表达的上游调控因子为IbWRKY1。
[0012]因此，本专利技术的第一个目的是提供一种紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子 IbWRKY1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种上述的上游调控因子IbWRKY1的编码基因，该编码 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供一种含有上述的编码基因的重组载体或重组菌。
[0015]本专利技术的第四个目的是提供一种上述的上游调控因子IbWRKY1的扩增引物，该扩增 引物的具体序列如下所示：
[0016]IbWRKY1
‑
F：5'
‑
ATGGCTGTAGAGTTGTTGTCTAGTTACAGG
‑
3'和
[0017]IbWRKY1
‑
R：5'
‑
TTAATGGTTGTGTTCTCCTTCGTAGG
‑
3'。
[0018]本专利技术的第五个目的是提供上述的上游调控因子IbWRKY1在促进紫心甘薯IbMYB1 转录因子表达中的应用。
[0019]本专利技术的第六个目的是提供上述的上游调控因子IbWRKY1在促进植物花色素苷生物 合成中的应用。
[0020]本专利技术的第七个目的是提供上述的上游调控因子IbWRKY1在植物高花色素苷品种选 育中的应用。
[0021]进一步的，所述的植物为紫心甘薯。
[0022]本专利技术人通过酵母单杂交的方法从cDNA文库中筛选出促进IbMYB1表达的上游调控 因子包括IbEBF1、IbSCF和IbWRKY1，但是不同上游调控因子的作用位点不同。IbMYB1 启动子分成四段，第二和第三段具有控制不住的自激活活性，其中IbSCF和IbWRKY1作 用位点在第一段(位于启动子的前面)，而IbEBF1作用位点在第四段(位于启动子的后面)。
[0023]进一步的，为了进一步验证筛选出来的上游调控因子IbWRKY1与启动子IbMYB1结 合，将IbWRKY1构建到pGADT7酵母重组表达载体，选择载体中EcoRⅠ和BamHⅠ作 为目的片段插入的酶切位点，合成引物序列见表2。将pGADT7
‑
IbWRKY1酵母重组表达载 体质粒与pAbAi
‑
PIbMYB1诱饵载体共同转化Y1HGold酵母中进行酵母单杂交实验，结果 发现：阳性对照p53AbAi+AD53转化的菌株在SD/
‑
Leu/AbA培养基上能够生长，而阴性对 照pAbAi
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PIbMYB1+pGADT7空载转化的菌株不能在SD/
‑
Leu/AbA培养基上生长。说明该 酵母单杂交实验能够本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbWRKY1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种编码权利要求1所述的紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbWRKY1的基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或重组菌。5.一种权利要求1所述的紫心甘薯IbMYB1转录因子的上游调控因子IbWRKY1的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为IbWRKY1
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F：5'
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ATGGCTGTAGAGTTGTTGTCTAGTTACAGG
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3'和IbWR...

【专利技术属性】
技术研发人员：付丹文，惠亚可，李旭辉，高峰，
申请(专利权)人：广东省科学院南繁种业研究所，
类型：发明
国别省市：