油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用制造技术

本发明专利技术提供油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用，是一种油菜(Brassica napus)分泌肽基因BnRALF10在菌核病防控中的应用，通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用。本发明专利技术构建了该基因的超表达和RNAi转基因油菜，首次揭示了该基因对油菜菌核病抗性的强烈正调控功能，提供了通过创制BnRALF10基因超表达油菜来获取菌核病抗性显著增高的油菜材料的应用、以及通过创制BnRALF10

【技术实现步骤摘要】
油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用


[0001]本专利技术属植物抗病性生物
，涉及油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用，具体是涉及油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病调控功能在菌核病防控中的应用。

技术介绍

[0002]1、植物抗病遗传学调控技术植物抗病性是一种寄主植物抵抗病原物侵染和危害的遗传性状，由基因控制。植物受体通过识别病原物配体激活抗病信号传导是植物抵御病原物的第一道屏障。定位于细胞膜外的激发子配体是开启植物防卫反应的钥匙。因此，这些激发子基因在赋予植物抗病性中起决定性作用。为了精确地感知来自病原物的危险信号，植物进化出大量的分泌肽，起损伤相关分子模式(Damage
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associated molecular patterns,DAMPs)等免疫激发子作用。迅速碱化因子(Rapid alkalinization factors,RALFs)就是一类DAMP，对多类病原物的植物免疫均起重要激发和调控作用。因此，利用RALF基因创制抗病性增强的作物种质具有抗性调控效果好、对不同病原物的抗性具有广谱调控作用等优点。
[0003]2、菌核病防控技术植物菌核病由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染所致。核盘菌是死体营养型(necrotroph)病原真菌，寄主范围极广，是油料作物以及蔬菜作物等的主要病害。每年造成巨大经济损失。由于对该菌的免疫抗性调控机制的理解不够深入，缺乏稳定的高抗品种，化学防治仍然是主要手段。但化学防治易污染环境、降低土质，病原菌还具有潜在抗药性，用药管理不当可能对未来的作物产量构成潜在威胁，且最佳施用时期难以预测。鉴定重要抗菌核病调控基因，创制和利用抗病品种，对于菌核病的绿色防控至关重要。
[0004]3、植物抗病育种技术主要可分为传统抗病育种和通过基因工程抗病育种两大类。传统抗病育种因为有天然遗传隔离现象使抗病资源可用范围受到显著限制，只能应用遗传关系较近的抗病资源，而且需要多次杂交和回交等，因此选育周期长，且需要大量人力物力。而基因工程育种方法是通过将外源的抗病调控基因通过农杆菌介导的方法等技术导入植物，使其获得原来不具有的抗病性。因此，基因工程育种方法打破了天然遗传隔离现象的限制，拓宽了抗病资源可用范围，而且具有操作相对简单方便、培育周期短、无需大量人工物力的特点。另外，可通过导入一个广谱抗病调控基因，或者多个不同抗病谱的基因，创制具有广谱抗病的品种。因此具有特别适宜培育广谱、持久抗病品种等优点。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用，所述功能是指油菜(Brassica napus)分泌肽基因BnRALF10对抗病性的激发调控功能，可在创制抗菌核病(病原物：核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))种质中的应用。
[0006]所述应用是通过创制转基因油菜(Brassica napus)来获取抗病性得到改变的油
菜材料中的应用。通过创制超表达BnRALF10的转基因油菜来获得增强菌核病抗性的油菜材料中的应用。或通过创制BnRALF10
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RNAi转基因油菜来获得降低菌核病抗性的油菜材料中的应用。
[0007]本专利技术以油菜中双11品种cDNA为模板，通过PCR克隆获得油菜基因BnRALF10，其核苷酸序列如SEQ ID：1所示，该基因的开放阅读框(ORF)长360bp，编码的蛋白由119个氨基酸组成，其序列如SEQ ID：2所示。BnRALF10蛋白由前体蛋白剪切加工而来，含有RRIL、YISY等功能基序。本专利技术克隆的BnRALF10核苷酸和蛋白序列分别与NCBI数据库中油菜品种ZS11的LOC106379883核苷酸和XP_013675189.1蛋白序列相同。
[0008]在本专利技术之前，该基因的功能没有任何公开报告。本专利技术首次通过构建该基因的超表达和RNAi转基因油菜及其抗病分析，阐明了该基因对油菜菌核病抗性的调控作用及机制。结果显示，与非转基因野生型对照油菜植株相比，超表达转基因油菜植株显著更抗核盘菌，而RNAi转基因植株显著更感核盘菌，说明BnRALF10强烈正调控油菜对核盘菌的抗性。
[0009]基于以上本专利技术阐明的BnRALF10基因功能，本专利技术的应用目的是提供所述的油菜BnRALF10基因通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，包括(1)在通过创制超表达BnRALF10的转基因油菜来获得增强对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例1中的说明)；以及(2)在通过创制BnRALF10
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RNAi的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用(具体见实施例2中的说明)。
[0010]1.油菜BnRALF10基因在通过创制超表达BnRALF10的转基因油菜来获得增强对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：(1)BnRALF10基因超表达结构的构建和获取将BnRALF10基因开放阅读框(ORF)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达；(2)转化BnRALF10基因超表达结构的农杆菌的获取将构建好的BnRALF10超表达结构通过电击转化法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)超表达BnRALF10的转基因油菜创制和获取通过农杆菌介导法将BnRALF10基因超表达结构导入油菜，获取转BnRALF10基因超表达结构的油菜；(4)超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和BnRALF10基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系；(5)对菌核病抗性增强的超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取以超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系为材料，检测分析对菌核病的抗性，获取抗病性增强的转BnRALF10基因油菜。
[0011]2.油菜BnRALF10基因在通过创制BnRALF10
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RNAi的转基因油菜来获得降低对菌核病抗性的油菜材料中的应用。通过以下步骤实现：(1)BnRALF10基因RNAi结构的构建和获取将BnRALF10基因的正向干扰片段和反向干扰片段通过同源重组方法分别依次克
隆入RNAi载体(pART
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RNAi)载体，获取BnFER1的RNAi结构pART
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RNAi
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BnRALF10；(2)转化BnRALF10基因RNAi结构的农杆菌的获取将BnRALF10基因RNAi结构(pART
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RNAi
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BnRALF10)通过热击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株；(3)转BnRALF10基因RNAi结构油菜的创制和获取通过农杆菌介导法将BnRALF10基因RNAi结构导入油菜，获取转BnRALF10基因RNAi结构的油菜；(4)转BnRALF10基因RNAi结构油菜纯合系本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种油菜分泌肽基因BnRALF10的抗病功能应用，其特征在于，所述功能是指油菜(Brassica napus)分泌肽基因BnRALF10对抗病性的激发调控功能，所述应用是通过创制转基因油菜来获取抗病性得到改变的油菜材料中的应用，所述基因核苷酸序列如SEQ ID：1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID：2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在通过创制超表达BnRALF10的转基因油菜来获得增强菌核病抗性的油菜材料中的应用。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在通过创制BnRALF10
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RNAi转基因油菜来获得降低菌核病抗性的油菜材料中的应用。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现获得增强菌核病抗性的油菜材料中的应用：(1)BnRALF10基因超表达结构的构建和获取将BnRALF10基因开放阅读框(ORF)克隆入一个植物表达载体，使其受强启动子的驱使表达，(2)转化BnRALF10基因超表达结构的农杆菌的获取将构建好的BnRALF10基因超表达结构通过热击等方法转化对油菜具有强侵染能力的农杆菌菌株，(3)超表达BnRALF10的转基因油菜创制和获取通过农杆菌介导法将BnRALF10基因超表达结构导入油菜，获取转BnRALF10基因超表达结构的油菜，(4)超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系的获取分别以抗生素抗性和BnRALF10基因表达为检测指标，检测转基因植株后代的性状分离情况，获取后代性状不再分离的、并能稳定遗传的超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系，(5)对菌核病抗性增强的超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系筛选鉴定和获取以超表达BnRALF10的转基因油菜纯合系为材...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡新忠，何语涵，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：