用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂制造技术

本发明专利技术涉及用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂。本发明专利技术提供了使用包含编码iPS细胞诱导因子的单链mRNA的纯化的RNA制剂重编程体细胞的组合物和方法。纯化的RNA制剂优选大体上不含RNA污染分子，所述RNA污染分子：i)可激活体细胞的免疫反应，ii)减少体细胞中单链mRNA的表达，和/或iii)激活体细胞中的RNA传感器。在某些实施方案中，纯化的RNA制剂大体上不含部分mRNA、双链RNA、未加帽的RNA分子和/或单链连缀mRNA。分子和/或单链连缀mRNA。分子和/或单链连缀mRNA。

【技术实现步骤摘要】
用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂
[0001]本申请是申请日为2010年12月7日，申请号为201610971165.2，专利技术名称为“用于重编程细胞的包含纯化的经修饰的RNA的RNA制剂”的专利技术专利的分案申请。
[0002]本申请要求于2009年12月7日提交的美国临时申请序列No.61/267,312(将其通过引用整体并入本文)的优先权。
[0003]本申请还要求于2009年3月27日提交的美国申请序列No.11/990,646号(所述申请为于2006年8月21日提交的进入美国国家阶段的PCT/US06/32372，PCT/US06/32372要求于2005年8月23日提交的美国临时申请No.60/710,164的优先权)的优先权，将所有所述申请通过引用整体并入本文。
专利

[0004]本专利技术涉及通过将细胞与纯化的RNA制剂接触来改变或重编程真核细胞(包括人或其它动物细胞)的分化状态的组合物和方法，所述RNA制剂包含由一种或多种不同的各自编码重编程因子(例如，iPS细胞诱导因子)的单链mRNA分子或由所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种降低通过体外转录获得的体外合成的RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的制剂对哺乳动物细胞的免疫原性的非治疗方法或体外方法，所述RNA分子包含替代尿苷(U)的选自假尿苷(Ψ)、1
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甲基假尿苷(m1Ψ)、5
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甲基尿苷(m5U)、5
‑
甲氧基尿苷(mo5U)和2
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硫尿苷(s2U)的修饰核苷，其中所述RNA分子编码重组蛋白，所述方法包括：纯化所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的制剂以除去通过诱导先天性免疫反应而对哺乳动物细胞具有毒性的污染物，所述污染物包括双链RNA分子；从而产生包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的纯化的RNA制剂，其与未进行所述纯化的RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的相同制剂相比，在所述哺乳动物细胞中显示降低的免疫原性。2.权利要求1所述的方法，其中所述体外合成的RNA分子的制剂在其中至少一部分UTP已被选自Ψ、m1Ψ、m5U、mo5U和s2U的修饰核苷的相应三磷酸酯衍生物替代的反应中通过体外转录而获得。3.权利要求2所述的方法，其中所述体外合成的RNA分子的制剂进一步包含修饰核苷5
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甲基胞苷(m5C)，并且在其中至少一部分CTP也已被m5C的相应三磷酸酯衍生物替代的反应中通过体外转录而获得。4.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述通过诱导先天性免疫反应而对所述哺乳动物细胞具有毒性的污染物进一步包括未加帽的RNA分子。5.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述纯化的RNA制剂的所述降低的免疫原性通过测量将所述纯化的RNA制剂引入所述细胞或使所述细胞与所述纯化的RNA制剂接触后缺乏炎性细胞因子的产生而检测。6.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述纯化的RNA制剂的所述降低的免疫原性通过测量与引入或接触未进行所述纯化的相同量的所述RNA制剂的细胞相比，由引入或接触所述纯化的RNA制剂的细胞对选自IL
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12、IFN
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α、TNF
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α、RANTES、MIP
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1α、MIP
‑
1β、IL
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6、IFN
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β和IL
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8的细胞因子的较少分泌而检测。7.权利要求中1
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3中任一项所述的方法，其中所述经纯化的RNA制剂：(a) 不含一定量的RNA污染分子，所述RNA污染分子如果存在，在引入或接触所述哺乳动物细胞后，将能够激活足以阻止所述细胞存活的免疫反应；(b) 可以重复给予而不引起足以可检测地降低由所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体编码的所述重组蛋白表达的免疫反应；(c) 可以重复引入而不引起足以消除由所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体编码的所述蛋白的可检测表达的免疫反应；和/或(d)可在不触发可检测的免疫反应的情况下给予。8.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述纯化的RNA制剂使用选自以下的至少一种方法产生：a)一种过程，包括用特异性消化一种或多种污染RNA或污染DNA核酸的一种或多种酶处理所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体，使得产生所述纯化的RNA制剂；b)一种过程，包括使包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的组合物经
历柱纯化，使得产生所述纯化的RNA制剂；和c)一种过程，包括用核糖核酸酶III(RNA酶III)处理包含所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体的组合物，使得产生短的RNA酶III消化产物，然后从各所述RNA分子或包含所述RNA分子的基因治疗载体纯化掉所述短的RNA酶III消化产物和RNA酶III，使得产生所述纯化的RNA制剂。9.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述纯化所述体外合成的RNA分子的制剂包含至少一种选自以下的过程：(i) HPLC；和(ii) 用RNA酶III处理，使得产生短的RNA酶III消化产物，和将所述短的RNA酶III消化产物与所述制剂分离，使得所述制剂不含所述短的RNA酶III消化产物。10.权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述纯化的RNA制剂包含体外合成的mRNA分子，所述mRNA分子具有编码所述重组蛋白的开放阅读框架并具有选自以下的至少一个其它特征：i) 5'帽；ii) 具有包含50
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200或大于150个核苷酸的3'多聚腺苷酸尾；iii)异源5'UTR序列；iv)Kozak序列；v)IRES序列；vi)3'UTR序列；vii)来自非洲爪蟾或人α珠蛋白或β珠蛋白mRNA的5'UTR序列；viii)来自非洲爪蟾或人α珠蛋白或β珠蛋白mRNA的3'UTR序列；ix)来自烟草蚀纹病毒(TEV) RNA的5'UTR序列；和x)修饰的核苷5
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甲基胞苷替代至少一部分相应的未修饰的核苷胞苷。11.权利要求10所述的方法，其中所述重组蛋白选自：红细胞生成素(EPO)；选自萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、细菌β
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半乳糖苷酶(lacZ)和绿色荧光蛋白(GFP)的可检测酶；选自MYC和SRY或MCOP的转录因子；生长因子或细胞因子，其选自血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子
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β1 (TGF
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β1)、胰岛素
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样生长因子(IGF)、α
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促黑色素细胞激素(α
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MSH)；胰岛素
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样生长因子
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I (IGF
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I)；IL
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4；IL
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13；和IL
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10；可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)；热激蛋白；囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)；具有抗氧化剂活性的酶，其选自过氧化氢酶、磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化酶、超氧化物歧化酶
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1和超氧化物歧化酶
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2；Bruton
’
s酪氨酸激酶；腺苷脱氨酶；和外
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核苷三磷酸二磷酸水解酶。12.权利要求10所述的方法，所述方法还包括使哺乳动物细胞与包含所述体外合成的mRNA分子的纯化的RNA制剂接触，从而诱导所述哺乳动物细胞产生编码的重组蛋白。13.权利要求12所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是人类细胞。14.权利要求12或13所述的方法，其中所述细胞位于体外、在培养中或在生命维持培养基中，作为许多分离的细胞之一或作为真核组织或器官的细胞。15.权利要求1
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3和11
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13中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：a)将所述细胞与至少一种生长因子和/或细胞因子接触，所述生长因子和/或细胞因子选自：TGF、PDGF
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BB、干细胞因子(SCF)、FMS
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样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、粒细胞集落刺激
因子(G
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CSF)、IL
‑
3、IL
‑
6、红细胞生成素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子2(IGFII)和骨形态发生蛋白4(BMP
‑
4)；和/或b)将编码选自以下的至少一种细胞因子或生长因子的修饰mRNA引入所述细胞，所述细胞因子或生长因子选自：TGF、PDGF
‑
BB、干细胞因子(SCF)、FMS
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样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、粒细胞集落刺激因子(G
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CSF)、IL
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3、IL
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6、红细胞生成素、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子2(IGFII)和骨形态发生蛋白4(BMP
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4)。16.权利要求1
‑
3和11
‑
13中任一项所述的方法，其中所述体外转录的RNA分子具有包含至少120个核苷酸的长度。17.使用权利要求1
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16中任一项所述的方法制备的药物或药物组合物，其中所述RNA分子包含修饰的mRNA分子，其编码所述重组蛋白，和其中给予所述药物或药物组合物以治疗或校正受试者的包括单基因障碍或先天性代谢缺陷的障碍。18.权利要求17所述的药物或药物组合物，其进一步包含以下中的至少一种：
‑ꢀ
药学上可接受的载体或稀释剂；
‑ꢀ
转染试剂。19.权利要求18所述的药物或药物组合物，其中所述转染试剂选自基于脂质的转染试剂、基于蛋白质的转染试剂、基于聚乙烯亚胺的转染试剂和磷酸钙。20.权利要求19所述的药物或药物组合物，其中所述基于脂质的转染试剂是阳离子脂质试剂。21.权利要求19或20所述的药物或药物组合物，其中所述药物组合物的转染试剂形成脂质体。22.由使用权利要求1
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16中任一项所述的方法获得的RNA分子组成的纯化的RNA制剂在制备药物或药物组合物中的用途，所述药物或药物组合物用于诱导受试者的哺乳动物细胞产生所述重组蛋白以用于治疗障碍或用于将治疗性蛋白体内递送至组织；其中所述障碍的治疗或治疗性蛋白质体内递送至组织包括将所述药物或药物组合物给予受试者。23.权利要求22所述的用途，其中所述给予不触发可检测的免疫反应。24.权利要求23所述的用途，其中可检测的免疫反应的缺乏可通过在所述给予后测量选自IL
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12、IFN
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α、TNF
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α、RANTES、MIP
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lα或β、IL
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6、IFN
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β或IL
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8的至少一种细胞因子的分泌无增加来确定。25.利要求22
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24中任一项所述的用途，其中所述药物或药物组合物进一步包含以下中的至少一种：
‑ꢀ
药学上可接受的载体或稀释剂；
‑ꢀ
转染试剂。26.权利要求25所述的用途，其中所述转染试剂选自基于脂质的转染试剂、基于蛋白质的转...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯塔林，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚州大学信托人，
类型：发明
国别省市：