无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3D打印用生物墨水技术

本发明专利技术涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制备方法、粉末形式和液体形式的无洗涤剂去细胞化ECM、初级生物墨水的制备方法、初级生物墨水、脉管生物墨水的制备方法、脉管生物墨水、包含初级生物墨水和/或脉管生物墨水的三维结构和该三维结构的制备方法。和该三维结构的制备方法。和该三维结构的制备方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】无洗涤剂去细胞化细胞外基质的制备方法和3D打印用生物墨水


[0001]本专利技术涉及一种无洗涤剂去细胞化ECM的制备方法、粉末形式和液体形式的无洗涤剂去细胞化ECM、初级(primary)生物墨水的制备方法、初级生物墨水、脉管(vascular)生物墨水的制备方法、脉管生物墨水、包含初级生物墨水和/或脉管生物墨水的三维结构和该三维结构的制备方法。

技术介绍

[0002]生物打印能够自动沉积活细胞和其他成分，以形成三维(3D)组织结构体。生物墨水制剂由不同来源产生，包括合成聚合物和天然聚合物，如胶原、明胶、海藻酸盐、透明质酸、纤维蛋白和聚乙二醇。众所周知，用于生物打印的基质材料不能代表自然细胞外基质(ECM)的复杂性，ECM构成细胞的微环境，并且可以调节细胞过程，包括迁移、分化和其他功能。因此，生物墨水中ECM的存在被认为有利于重建具有细胞
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细胞连接的微环境。
[0003]国际专利申请WO2017014582揭示了一种生物墨水组合物，其包含0.05至60
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106/mL细胞、0.1至10w/v％细胞载体材料、0.01至1w/v％增粘剂、1至30v/v％润滑剂和0.1至10w/v％结构材料。生物墨水组合物可进一步包含组织源性成分材料。优选地，细胞载体材料为明胶或胶原，增粘剂为透明质酸或葡聚糖，润滑剂为甘油，结构材料为纤维蛋白原或甲基丙烯酸明胶(GelMa)。
[0004]文献包括许多关于选择具有最佳性质的适当生物墨水组合物用于组织工程应用的问题的出版物。Mohamed Ali等人开展了有关基于衍生自肾脏的去细胞化ECM(dECM)的生物墨水的生产的工作[1]。使用0.5M乙酸和0.1mg/mL胃蛋白酶，采用溶解法获得相对低浓度(1％至3％)的dECM水凝胶。另外，通过添加光引发剂(Irgacure)对dECM进行甲基丙烯酸化处理。
[0005]随后的研究小组试图使用添加甲基丙烯酸明胶(GelMa)和光引发剂(即LAP)(苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰亚膦酸锂)的ECM获得生物墨水[2]。另一些人使用以相对高浓度的胃蛋白酶获得的dECM水凝胶，添加聚己内酯(PCL)作为保存合成剂[3]。
[0006]专利说明KR20180125776描述了一种包含dECM粉末和水凝胶的生物墨水组合物。dECM粉末可选自肝组织、心脏组织、软骨组织、骨组织、脂肪组织、肌肉组织、皮肤组织、粘膜上皮组织、羊膜组织或角膜组织。优选地，dECM粉末的粒径为0.05μm至100μm。水凝胶可包含选自由明胶、透明质酸、葡聚糖和胶原组成的组的一种或多种。
[0007]Falguni等人(2014)开发了组织特异性dECM生物墨水，包含脂肪、软骨和心脏组织，能够为细胞植入、存活和长期功能提供关键线索。生物打印方法能够重建固有的细胞形态和功能。通过有组织的空间模式和组织特异性基因表达，观察到打印细胞结构体的高阶组装。方法论的关键优势是应用组织特异性ECM，为细胞植入、存活和长期功能提供关键线索[3]。
[0008]许多研究小组已经对涉及器官去细胞化以获得dECM作为生物墨水成分的实验进
行了研究[4，5，7]。各种物质用于去细胞化，主要是Triton X
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100和/或十二烷基硫酸酯(SDS)洗涤剂。KR1020180011607A中描述了一种肝脏去细胞化方法，其中肝组织用含有表面活性剂和超活性溶液的去饱和溶液处理。0.5％的Triton X
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100(Triton X
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100)可用作表面活性剂。
[0009]Mohamed Ali及其同事构建了包含ECM源性生物墨水的光交联肾脏[1]。猪的整个肾脏通过灌注法去细胞化，溶解在酸性溶液中，并通过甲基丙烯酸进行化学修饰。结果表明，生物打印的人肾细胞具有很高的存活率，并随着时间的推移而成熟。此外，生物打印的肾脏结构体显示了天然肾组织的结构和功能特征。组织特异性ECM源性生物墨水可增强细胞成熟并最终增强组织形成。
[0010]Mirmalek
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Sani等人(2013年)介绍了猪胰腺的去细胞化过程，以创建人类干细胞和猪胰岛的支架。细胞材料被有效去除，同时保留ECM蛋白和天然脉管系统。此外，研究表明，去细胞化的胰腺可支持细胞粘附和细胞功能的维持[6]。

技术实现思路

[0011]本专利技术的目的是提供一种可用于生物打印的无洗涤剂dECM。文献数据未提供关于通过去细胞化获得的ECM中洗涤剂残留量或其含量测定方法的结果。在先前公布的各种组织去细胞化程序中，去除洗涤剂的阶段相对较短。据认为，dECM中不含洗涤剂会实质上影响所获得dECM的质量。申请人开发的流程允许去除几乎所有的洗涤剂，而无需添加其他化学品。本专利技术的第二个目的是获得具有适当稠度(consistency)和粘度的生物墨水，而无需添加粘度增强剂。
[0012]在第一方面中，提供一种无洗涤剂去细胞化细胞外基质(dECM)的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0013]‑
将选自胰腺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤、肺、大肠、小肠、动脉和静脉、脂肪组织和胎盘中的动物源性器官通过机械破碎，优选通过机械挤压，其中器官与动物的身体是分开的；
[0014]‑
在优选包含1
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磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲洗涤剂溶液中温育碎片(fragmented)器官，其中缓冲洗涤剂溶液包含0.5％至1.5％优选1％(v/v)的辛苯昔醇
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9，其中洗涤剂溶液补充有抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，并且温育在搅拌的条件下在低于室温优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤剂溶液中；
[0015]‑
在优选包含1
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PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第一缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
[0016]‑
在包含DNA酶的脱氧核糖核酸酶溶液中温育碎片器官，优选浓度为0.0001％至0.0003％(w/v)，最优选浓度为0.0002％(w/v)，优选在适合DNA酶性能的温度温育至少8小时；
[0017]‑
在优选包含1
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PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育碎片器官，其中第二缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温，优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将碎片器官转移到新鲜洗涤溶液
中；
[0018]‑
冷冻碎片器官并将冷冻的碎片器官压成碎片；
[0019]‑
将冷冻的碎片器官优选在
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32℃，优选在0.31mbar(本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种无洗涤剂去细胞化细胞外基质dECM的制备方法，所述方法包括以下步骤：
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将选自胰腺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤、肺、大肠、小肠、动脉和静脉、脂肪组织和胎盘中的动物源性器官通过机械破碎，优选通过机械挤压，其中所述器官与动物的身体是分开的；
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在优选包含1
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PBS的缓冲洗涤剂溶液中温育碎片器官，其中所述缓冲洗涤剂溶液包含0.5％至1.5％、优选1％(v/v)的辛苯昔醇
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9，其中所述洗涤剂溶液补充有抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，并且温育在搅拌的条件下在低于室温优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤剂溶液中；
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在优选包含1
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PBS的第一缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第一缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
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在包含DNA酶的脱氧核糖核酸酶溶液中温育所述碎片器官，优选浓度为0.0001至0.0003％(w/v)，最优选浓度为0.0002％(w/v)，优选在适合DNA酶性能的温度温育至少8小时；
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在优选包含1
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PBS的第二缓冲洗涤溶液中温育所述碎片器官，其中所述第二缓冲洗涤溶液包含抗微生物剂，优选链霉素，优选浓度为0.01％(w/v)，温育在搅拌的条件下在低于室温、优选为4℃的温度进行至少72小时，其中每4至12小时将所述碎片器官转移到新鲜洗涤溶液中；
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冷冻所述碎片器官并将冷冻的碎片器官压成碎片；
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将冷冻的碎片器官优选在
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32℃，优选在0.31mbar(31Pa)的压力下冷冻干燥；
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在0.0010mbar(0.1Pa)且
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76℃进行5至15分钟的可选的最终干燥；
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将经压碎并干燥的产品研磨成25μm至500μm的dECM粉末；
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可选灭菌产品，优选通过辐射和/或环氧乙烷进行。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述研磨步骤之后是检查dECM粉末中辛苯昔醇
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9的量的步骤，其中优选在检查dECM粉末中辛苯昔醇
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9的存在之前，将粉末用胶原酶处理，优选浓度为43,953PZ/gdECM。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述研磨步骤之后是以下步骤：
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将dECM粉末溶解在盐酸溶液中，溶液优选为0.01M，补充有0mg/ml至10mg/ml的胃蛋白酶；
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于室温混合48小时至72小时，优选72小时；
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在冰上中和，优选使用0.1M钠基和PBS溶液。4.一种粉末形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过根据权利要求1或2所述的方法获得。5.一种溶液形式的无洗涤剂去细胞化ECM，其能够通过根据权利要求3所述的方法获得。6.一种初级生物墨水的制备方法，所述方法包括以下步骤：
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通过混合制备包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据权利要求4的dECM粉末和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据权利要求5的dECM溶液的糊料；
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在7℃至10℃的温度温育糊料至少24小时；
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添加1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶、0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸和5％至10％(w/v)的甘油，以及光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰亚膦酸锂，然后轻柔混合。7.一种初级生物墨水，所述墨水包含dECM糊料和1.46％至7.32％(w/v)的甲基丙烯酸明胶、0.15％至1.10％(w/v)的甲基丙烯酸透明质酸和5％至10％(w/v)的甘油，以及光引发剂，优选0.03％至0.17％(w/v)的苯基
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2,4,6
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三甲基苯甲酰亚膦酸锂，其中所述dECM糊料包含5％至50％(w/v)、优选15％至25％(w/v)的根据权利要求4的dECM粉末，和1％至10％(w/v)、优选8％至10％(w/v)的根据权利要求5的dECM溶液，并且其中所述初级生物墨水的粘度在锥板系统中，以21/s的恒定剪切速率和37℃的温度测量为至少5Pa
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s。8.根据权利要求7所述的初级生物墨水，所述墨水包含至少一种选自以下的添加剂：浓度为0.001至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.007mg/mL初级生物墨水的透明质酸，浓度为0.005至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.084mg/mL初级生物墨水的层粘连蛋白，浓度为0.001至0.100mg/mL初级生物墨水、优选0.041mg/mL初级生物墨水的胶原I，浓度为0.005至0.175mg/mL初级生物墨水、优选0.122mg/mL初级生物墨水的胶原IV，浓度为3至300μg/mL、优选100μg/mL的纤维连接蛋白，浓度为10至100mg/mL初级生物墨水的人纤维蛋白酶原，浓度为1至2EPU/mL初级生物墨水的抑肽酶，浓度为0.05至2mg/mL初级生物墨水的聚山梨醇酯，浓度为5至55mg/mL初级生物墨水的人凝血酶，浓度为20至60mM/mL初级生物墨水的氯化钙；促血管生成的维生素：浓度为1...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：波尔比奥尼卡公司，
类型：发明
国别省市：