一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提出一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法，包括载体，所述载体上设置有标记位点、T线、C线，所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应的被信号粒子标记的标记抗体，T线固定有与样本抗原和标记抗体发生双抗体夹心反应的捕获抗体，所述捕获抗体由与样本抗原的结合能力高低不同的两种抗体混合而成，C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原

【技术实现步骤摘要】
一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术属于体外诊断与免疫检测
，尤其涉及一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测复杂样本中药物、激素、蛋白质、微生物等物质存在或者浓度的分析方法。按照反应机制的不同，免疫分析可以分为竞争法和非竞争法。其中非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原
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标记抗体偶联物，产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将待测抗原与定量标记抗原（直接竞争）或者固定抗原（间接竞争）竞争结合形成定量的特异性抗体
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抗原偶联物，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原或者固定抗原的量越少，产生的信号强度越小，由此确定待测抗原的量。非竞争法中经典的双抗体夹心免疫反应的原理是以抗原为检测靶标，在固相载体的表面通过物理吸附或者化学检核的方式固定捕获抗体，溶液中抗原分别与标记抗体和捕获抗体结合，进而形成捕获抗体
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抗原
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标记抗体三元复合物，通过对标记抗体上标记物的检测，实现对抗原的定量检测。这种技术已经广泛应用于临床、环境、视频、海关等的检测中。当被测抗原的浓度较低时，双抗体夹心免疫检测的信号强度随待测抗原浓度增加呈现单调递增的关系；而当标本中的待测抗原浓度较高时，双抗体夹心免疫检测的信号强度将脱离现有线性关系增长缓慢，当标本中的待测抗原浓度继续升高时，信号强度逐渐趋于平缓甚至出现降低，从而使免疫检测失去准确定量高浓度待测抗原的能力，造成假阴性结果导致误诊。
[0003]上述现象称为HOOK效应，产生原因是因为当待测样本中抗原浓度很大时，一部分待测抗原与标记抗体部分处于游离状态，然后一起向检测线层析，占据检测线，与标记抗体偶联的抗原与检测线反应减少，因此检测线上信号值增长缓慢甚至出现降低的情况。
[0004]为减小夹心免疫分析中上述现象的影响，很多人做了研究工作，通过在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上分别通过双抗体夹心法和竞争法测定样品浓度，如专利CN105785009B中提出一种定量检测试纸条，在标记垫上涂覆有与待测样本对应并与其发生抗原抗体反应的标记抗体或抗原，在检测线上包被有与待测样本发生抗原抗体反应的相应抗体或抗原；在质控线上包被与标记垫上的标记抗体或抗原发生抗原抗体结合反应的相应抗原或抗体，通过计算检测线与质控线的信号值之比得到检测用标准曲线，上述方法在一定范围内扩宽了定量检测的范围，但是由于质控线上用于捕获标记抗体或抗原的为固定抗原或抗体，而固相抗原或抗体与待测样本中的液相抗原或抗体结合标记抗体或抗原的机会是不平等的，接近顺序饱和法，即只有与待测抗原或抗体结合后剩余的标记抗体或抗原才会与固相抗原或抗体结合，当待测样本浓度超出一定范围后，质控线上的信号变化会趋向于平缓，其与检测线信号值的比值梯度变化不明显甚至出现下降，而针对一些大分子蛋白如HCG（人绒毛膜促性腺激素）、人免疫球蛋白如IgE、IgG等，其强阳性样本中的含量会高出正常人体内含量的103个数量级以上。以HCG为例，在一般孕妇怀孕时浓度可达到
200000mIu/ml，远远超过了上述技术方案中的检测范围，现有的其他HCG定量检测试剂，线性范围均在10000mIu/ml附近，更高范围的检测均需要多步稀释至线性范围内进行检测后再通过乘以稀释倍数来计算得到理论的浓度值，不仅检测步骤复杂，容易形成操作误差，且临床上理论推导的结果会受到稀释液基质效应等因素的影响，而产生与真实高值样本含量的偏差。而HCG在孕早期，每日会成倍数增长，一般可达到200000miu/ml，且孕早期的HCG变化呈日倍增的情况，规律倍增能够有效判断胚胎发育情况，避免葡萄胎、宫外孕或胚胎发育不良等情况，故为确保检测方法简便、精确，对临床样本直接检测并显著地扩宽其检测范围，在免疫学检测领域至关重要。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种扩展定量检测范围的试剂盒和检测方法，以克服现有的大分子蛋白定量检测范围窄的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的，一种扩展定量检测范围的试剂盒，包括载体，所述载体上设置有标记位点、检测位点（T线）和质控位点（C线），所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应被信号粒子标记的抗体（以下简称标记抗体），T线固定有与样本抗原发生特异性反应的捕获抗体，捕获抗体是由两种与样本抗原结合能力不同的抗体混合包被而成，C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原
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抗体偶联物。
[0007]所述信号粒子包括但不限于荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒，其中荧光粒子又包括荧光微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球，本专利技术中优选荧光微球，荧光微球的粒径为100
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800nm。
[0008]所述标记抗体和捕获抗体分别结合样本抗原的不同点位，形成标记抗体
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抗原
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捕获抗体偶联物（双抗体夹心）；C线上的抗原
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抗体偶联物与标记抗体结合形成标记抗体
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抗原
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抗体偶联物。
[0009]T线上的捕获抗体中，结合能力高的抗体与结合能力低的抗体混合摩尔比例为1：1
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1：20。
[0010]C线上的抗体可以为T线上捕获抗体的任一一种，也可以为不同的捕获抗体。
[0011]所述样本通常是指被怀疑含有待测抗原的生物材料，包括但不限于血液、尿液等，样本中的抗原具有两个或多个结合位点，即样本抗原为大分子蛋白。
[0012]所述载体优选微流控芯片，包括相互扣合的盖片和底片，盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽，底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区，所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内，样本经加样孔流入微通道，流经标记区后进入检测区进行生化反应，最终流入废液槽后终止反应，反应时间为2
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10min。
[0013]所述载体上的T线和C线预先包被有亲和素/链霉亲和素用于偶联生物素化的抗体或抗原，T线上的捕获抗体为生物素化的两种结合能力不同的抗体按比例混合均匀而成，C线上的抗原
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抗体偶联物为生物素化的单克隆抗体和游离的抗原偶联而成。
[0014]所述C线上抗体与抗原的摩尔比为1:0.5
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1：5。
[0015]本专利技术还提供了一种利用上述试剂盒（载体上设置标记位点、T线和C线）定量检测大分子蛋白的检测方法：
S1，标准曲线的绘制：将一系列浓度的待测样本标准品分别用上述试剂盒反应2
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10分钟，得到所述T线和C线的信号值之比；重复上述步骤3
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5次，得到T线和C线的信号值之比的平均值，以其为纵坐标、待测样本标准品的浓度为横坐标得到标准曲线；S2，向试剂盒中滴加定量的待测样本，使样本与本专利技术中的试剂盒反应2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种扩展定量检测范围的试剂盒，包括载体，所述载体上设置有标记位点、T线、C线，其特征在于，所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应的被信号粒子标记的标记抗体，T线固定有与样本抗原和标记抗体发生双抗体夹心反应的捕获抗体，所述捕获抗体由与样本抗原的结合能力高低不同的两种抗体混合而成，C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原
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抗体偶联物。2.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于，所述载体为微流控芯片，包括相互扣合的盖片和底片，盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽，底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区，所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内，样本经加样孔流入微通道，流经标记区后进入检测区进行生化反应，最终流入废液槽后中止反应，反应时间为2
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10min。3.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于，所述T线上结合能力高的抗体与结合能力低的抗体混合摩尔比例为1：1
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1：20。4.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于，所述C线上抗体与抗原的摩尔比为1:0.5
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1：5。5.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于， C线上的抗原
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抗体偶联物为生物素化的抗体和特异性抗原偶联而成。6.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于，所述载体上的T线和C线预先包被有亲和素/链霉亲和素。7.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒，其特征在于，所述信号粒子包括但不限于荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒中的一种。8.一种定量检测大分子蛋白的检测方法，其特征在于，采用权利要求1
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7中任一试剂盒进行检测，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李昀地，王俊水，李慧，许人茂，周洪锐，魏华英，刘钟泉，赵娜，张粲，肖福磊，秦月，李轩，贺敬文，刘陈针玉，钱龙，李娜，孟佳，李洲，
申请(专利权)人：天津中新科炬生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：