基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法技术

本发明专利技术涉及基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上，构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，即所述脂肪酶表面展示大肠杆菌。本发明专利技术的合成方法解决了解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题。问题。问题。

【技术实现步骤摘要】
基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法


[0001]本专利技术涉及生物技术和微生物发酵领域，特别涉及一种基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。

技术介绍

[0002]丁酸丁酯是一种应用广泛的短链脂肪酸酯，作为溶剂广泛用于有机合成过程；因具有梨、菠萝样香气，是调制食品、饮料及日用化妆品、香精等不可缺少的原料，也是我国 GB2760
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86 规定允许使用的食用香料。此外，丁酸丁酯在低温下具有与航空柴油相似的理化性质，可直接用作航空燃料，是一种更高附加值的燃料添加剂。丁酸丁酯天然存在于菠萝、香蕉和草莓等水果中，然而含量非常低。
[0003]传统生产工艺以丁酸和丁醇为原料、浓硫酸为催化剂，通过酯化反应合成，该工艺虽然技术成熟、产品收率高，但存在副反应多、设备腐蚀严重、“三废”排放量大等弊端。因此，迫切需要开发新型生产工艺，实现丁酸丁酯的高效合成。生物发酵法合成丁酸丁酯能以可再生的生物质为原料，具有反应条件温和、产品纯度高、过程绿色环保等优势。目前，生物发酵法合成丁酸丁酯基于合成类型主要分为四类：（1）一步发酵法直接合成丁酸丁酯，即以单糖为底物直接发酵合成丁酸丁酯；（2）基于溶剂梭菌ABE发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁酸和脂肪酶合成丁酸丁酯；（3）基于产丁酸梭菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加丁醇和脂肪酶合成丁酸丁酯；（4）溶剂梭菌和产丁酸梭菌混菌发酵合成丁酸丁酯，即以单糖为底物，外源添加脂肪酶。利用脂肪酶催化合成丁酸丁酯，产品纯度高，然而酶成本较高，限制了其大规模应用。
[0004]生物法合成丁酸丁酯中的关键步骤为一个以丁酸和丁醇为底物，生成丁酸丁酯的酯化反应，反应中的催化剂可由脂肪酶承担。脂肪酶又名甘油酯水解酶，可催化三酰甘油水解生成游离脂肪酸和甘油，在微环境中的水解反应是可逆的。脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，除了对三酰甘油酯有水解活性，还可催化酯化反应，转酯反应，氨解反应等。脂肪酶参与的催化反应具有不需要辅酶、反应条件温和、副产物少等优点。目前较常用的工业化脂肪酶中，有诺维信公司推出的商品固定化脂肪酶—诺维信435。诺维信435通过将来源于南极假丝酵母的脂肪酶B（CALB）吸附于丙烯酸树脂制得，市价约为200元/克，价格昂贵，提高了生物法合成丁酸丁酯的成本。

技术实现思路

[0005]为了解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题，本专利技术提供了一种基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法。
[0006]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；
所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上，构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，即所述脂肪酶表面展示大肠杆菌；其中，所述脂肪酶lipA Genbank登录号为WP_034581463.1；所述锚定蛋白estA来源于Genbank登录号为NC_002516.2的铜绿假单胞菌基因组。
[0007]作为一种优选的实施方式，所述表达载体选用pET29a。
[0008]作为一种优选的实施方式，所述产丁酸丁酯菌株选自丙酮丁醇梭菌、酪丁酸梭菌中的一种或两种；优选利用丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌混合发酵。
[0009]作为一种优选的实施方式，丙酮丁醇梭菌和酪丁酸梭菌接种比例为1:1~1:4。
[0010]作为一种优选的实施方式，在产丁酸丁酯菌株发酵24h后，加入所述发酵液/菌体沉淀。
[0011]作为一种优选的实施方式，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液获取方式为：将脂肪酶表面展示大肠杆菌接种于含卡那霉素的LB液体培养基中摇瓶培养至对数生长期，作为种子液；将所述种子液按接种到LB液体培养基中摇瓶培养至OD=0.6~0.8，再加入IPTG诱导培养，获取发酵液。
[0012]作为一种优选的实施方式，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀。
[0013]lipA是一个来源于丙酮丁醇梭菌的基因，可表达脂肪酶作为丁酸丁酯合成酯化反应中的关键酶。在无外源添加脂肪酶的情况下，丙酮丁醇梭菌单菌发酵仍有少量丁酸丁酯产量，由此推测丙酮丁醇梭菌可内源性表达脂肪酶。将脂肪酶展示于微生物表面，作为一种全细胞生物催化剂，在不需纯化和固定化的复杂工艺条件下，不仅可以直接使用，而且可重复利用，这将大大降低生产成本，本专利技术经筛选发现Genbank登录号为WP_034581463.1的脂肪酶lipA构建的脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株，其菌体沉淀催化产量接近诺维信，可作为诺维信的廉价替代，解决丁酸丁酯生物合成方法对外源脂肪酶依赖造成成本过高的问题，具有良好的应用潜能。
附图说明
[0014]图1为重组表达的质粒双酶切电泳验证结果；泳道1为核酸Marker；泳道2质粒双酶切结果，下方条带为脂肪酶与锚定蛋白融合基因。
[0015]图2为在三丁酸甘油脂酶活检测平板上的水解圈图；左列为丙酮丁醇梭菌来源的脂肪酶重组大肠杆菌表面展示菌株，出现明显透明水解圈；右列为对照空载质粒pET29a，无水解圈。
[0016]图3为实施例3中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比图。
[0017]图4为实施例4中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比图。
[0018]图5为实施例5中利用诺维信435、发酵液、菌体沉淀作为脂肪酶来源的产量对比
图。
[0019]图6为发酵产物产量变化图。
具体实施方式
[0020]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步具体详细描述，但本专利技术的实施方式不限于此，对未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
[0021]实施例中丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌ATCC 824（Clostridium acetobutylicum ATCC 824），酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌ATCC 25755（C. tyrobutyricum ATCC 25755），均为商业菌株。
[0022]实施例1重组脂肪酶WP_034581463.1大肠杆菌表面展示菌株pET29a
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estA
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Ca
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BL21的构建（1）在丙酮丁醇梭菌（C. acetobutylicum）基因组中经分析比对，得到编码脂肪酶lipA（GenBank登录号：WP_034581463.1）的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示；在登录号为NC_002516.2铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因组中经分析比对，得到编码锚定蛋白estA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：2所示；（2）设计本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于脂肪酶大肠杆菌表面展示菌株的丁酸丁酯合成方法，其特征在于，在产丁酸丁酯菌株发酵阶段，加入脂肪酶表面展示大肠杆菌的发酵液或同体积脂肪酶表面展示大肠杆菌发酵液离心后收集所得菌体沉淀；所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式为：将脂肪酶lipA的编码基因和锚定蛋白estA的编码基因克隆到表达载体上，构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，挑选阳性克隆，即所述脂肪酶表面展示大肠杆菌；其中，所述脂肪酶lipA Genbank登录号为WP_034581463.1；所述锚定蛋白estA来源于Genbank登录号为NC_002516.2的铜绿假单胞菌基因组。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述表达载体选用pET29a。3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述脂肪酶表面展示大肠杆菌构建方式包括：在丙酮丁醇梭菌基因组中经分析比对，得到编码脂肪酶lipA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：1所示；在登录号为NC_002516.2铜绿假单胞菌基因组中经分析比对，得到编码锚定蛋白estA的基因的完整核苷酸序列，序列如SEQ ID NO：2所示；设计引物以两种核苷酸片段混合物为模板进行PCR扩增，得到脂肪酶与锚定蛋白的融合基因，同时在序列上游引入NdeI酶切位点，在下游引入XhoI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；用限制性内切酶NdeI和XhoI分别对纯化的基因片段和载体质粒进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，取验证正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：信丰学，姜岷，陈泓羽，陆家声，蒋羽佳，姜万奎，章文明，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：