【技术实现步骤摘要】
适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用
[0001]本专利技术涉及一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用，属于基因工程领域。
技术介绍
[0002]基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome editing)或基因组工程(genome engineering)，是一种比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，现有技术中常用的主要包括以下三种特异性核酸酶：1、锌指核酸酶(ZFNs，Zincfingernucleases)；2、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN，Transcriptio nactivator
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likeeffectornucleases)；3、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)系统。
[0003]ZFNs在基因组编辑过程中，每个锌指单元只能识别3个固定碱基而非单个碱基，这导致靶向位点的选择有较高的限制性，并且该方法在编辑过程中较难，细胞毒性较高。TALE...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：包括PBBR1
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B质粒，PBBR1
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B质粒是以PBBR1为载体构建的重组载体，其上包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ
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Red重组酶的编码基因、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因、pyrF基因的下游同源臂。2.根据权利要求1所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述λ
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Red重组酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述Cas9n蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。3.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统的构建方法，其特征在于：所述PBBR1
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B质粒的构建方法，包括以下步骤：(1)构建Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒：将Pmin启动子与Cas9n连接，得到Pmin::Cas9n；将xylR
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pxylA启动子与λ
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Red连接，得到xylR
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pxylA::λ
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Red；将Pmin::Cas9n与xylR
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pxylA::λ
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Red连接，得到Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒；(2)构建PBBR1
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B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒、Ptrc启动子和编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段连接到pBBR1质粒上，得到PBBR1
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B质粒。4.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统在假单胞菌的基因编辑中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因编辑选自基因敲除、基因插入和/或基因替换。6.利用权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将λ
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Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1
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B质粒电转进入假单胞菌的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养，涂5
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FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n
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PxylA::λ
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Red表达盒替换了的突变菌株；(2)构建pUCP18
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A质粒：以假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别待敲除基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18
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A质粒；(3)将pUCP18
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A质粒电转进入步骤(1)所得突变菌株的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导...
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