适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统，包括PBBR1

【技术实现步骤摘要】
适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统及其构建方法与应用，属于基因工程领域。

技术介绍

[0002]基因编辑(gene editing)，又称基因组编辑(genome editing)或基因组工程(genome engineering)，是一种比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的一种基因工程技术或过程。基因编辑依赖于经过基因工程改造的核酸酶，现有技术中常用的主要包括以下三种特异性核酸酶：1、锌指核酸酶(ZFNs，Zincfingernucleases)；2、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN，Transcriptio nactivator
‑
likeeffectornucleases)；3、成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)系统。
[0003]ZFNs在基因组编辑过程中，每个锌指单元只能识别3个固定碱基而非单个碱基，这导致靶向位点的选择有较高的限制性，并且该方法在编辑过程中较难，细胞毒性较高。TALENs的向位点的选择更加灵活且应用更为广泛但TALENs相比于ZFNs蛋白尺寸较大，加大了导入细胞的难度，在编辑过程中难。相较于前两种人工核酸酶技术，CRISPR
‑
Cas系统是一种天然存在于原核生物RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是由gRNA指导的，通过RNA与DNA的剪辑配对实现靶序列的识别，故具有精确度高、操作简便、低成本等优点。但是，CRISPR
‑
Cas系统在原核基因组编辑中也存在一些不足，第一，CRISPR
‑
Cas9系统容易导致细菌死亡：CRISPR
‑
Cas9导致细菌双链DNA断裂，细菌缺少或低表达NHEJ系统的主要成分，从而使得断裂的DNA无法及时修复，造成细菌死亡；虽然多种重组酶，如SSr，λ
‑
Red的引入，能增加DNA修复效率，但其效果在不同菌株，不同基因位点差异很大。第二，CRISPR
‑
Cas9系统编辑效率差异很大：虽然该系统以高效闻名，但在不同位点效率差异很大(0.7％～100％)，极大限制了其在低编辑效率位点的应用。此外，该系统还存在大片段插入受限和质粒消除较为繁琐等问题，限制了其在原核细胞的广泛使用。
[0004]假单胞菌(Pseudomonas putida)属腐生革兰氏阴性假单胞菌，具有降解环境中有害芳香族及脂肪族类化合物、促进化学元素循环、生物催化、生物排污、合成生物塑料等多种功能的模式环境微生物菌株，也是基因克隆和蛋白表达的首选菌株之一，其基因组已在2002年被测序和解析。
[0005]利用CRISPR
‑
Cas9系统建立适用于假单胞菌的高效基因组编辑方法，理论上具有可行性，但其需要解决以下技术问题：
[0006]第一，针对Cas9蛋白引起致死的问题，需要设计合理策略避免Cas9引起的细菌细胞死亡。
[0007]第二，原核生物基因编辑需要同时引入2～3个质粒，易造成遗传不稳定等问题。
[0008]第三，针对现有基因组编辑系统不能进行大片段插入的问题，需要提高编辑效率实现大片段插入(大于10kb)。
[0009]第四，针对现有编辑方法效率不一且突变子难以筛选的问题，需要提高编辑效率
或添加选择标记实现突变子的快速筛选。
[0010]第五，针对现有的编辑方法质粒消除过程繁琐的问题，需要开发合适的质粒消除原件实现质粒的快速消除。

技术实现思路

[0011]针对上述现有技术，为实现高效的基因编辑，本专利技术提供了一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统——CRISPR/Cas9
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pyrF系统。
[0012]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0013]一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统CRISPR/Cas9
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pyrF，包括PBBR1
‑
B质粒，PBBR1
‑
B质粒是以PBBR1为载体构建的重组载体，其上包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ
‑
Red重组酶的编码基因(λ
‑
Red)、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因(Cas9n)、pyrF基因的下游同源臂。
[0014]所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该gRNA所靶向PyrF基因的20nt
‑
spacer序列为：5
’‑
ttcgaagcccttgtcacaca
‑3’
(如SEQ ID NO.3所示)。
[0016]所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]所述λ
‑
Red重组酶的编码基因(λ
‑
Red)的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0019]所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0020]所述Cas9n蛋白的编码基因(Cas9n)的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0021]所述PBBR1
‑
B质粒的构建方法，包括以下步骤：
[0022](1)构建Pmin::Cas9n
‑
xylR
‑
pxylA::λ
‑
Red表达盒：
[0023]将Pmin启动子与Cas9n连接(通过重叠延伸PCR技术，overlapPCR)，得到Pmin::Cas9n；
[0024]将xylR
‑
pxylA启动子与λ
‑
Red连接，得到xylR
‑
pxylA::λ
‑
Red；
[0025]将Pmin::Cas9n与xylR
‑
pxylA::λ
‑
Red连接，得到Pmin::Cas9n
‑
xylR
‑
pxylA::λ
‑
Red表达盒。
[0026](2)构建PBBR1
‑
B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n
‑
xylR
‑
pxylA::λ
‑
Red表达盒、Ptrc启动子和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：包括PBBR1
‑
B质粒，PBBR1
‑
B质粒是以PBBR1为载体构建的重组载体，其上包含有以下原件：Ptrc启动子、编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段，pyrF基因的上游同源臂、xylR—pxylA启动子、λ
‑
Red重组酶的编码基因、Pmin启动子、Cas9n蛋白的编码基因、pyrF基因的下游同源臂。2.根据权利要求1所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统，其特征在于：所述Ptrc启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述pyrF基因的上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述pyrF基因的下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述xylR—pxylA启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述λ
‑
Red重组酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述Pmin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述Cas9n蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。3.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统的构建方法，其特征在于：所述PBBR1
‑
B质粒的构建方法，包括以下步骤：(1)构建Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒：将Pmin启动子与Cas9n连接，得到Pmin::Cas9n；将xylR
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pxylA启动子与λ
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Red连接，得到xylR
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pxylA::λ
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Red；将Pmin::Cas9n与xylR
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pxylA::λ
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Red连接，得到Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒；(2)构建PBBR1
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B质粒：以假单胞菌A514基因组DNA为模板，PCR扩增得到pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂；将pyrF基因的上游同源臂、下游同源臂、Pmin::Cas9n
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xylR
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pxylA::λ
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Red表达盒、Ptrc启动子和编码“识别pyrF基因的gRNA”的DNA片段连接到pBBR1质粒上，得到PBBR1
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B质粒。4.权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统在假单胞菌的基因编辑中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因编辑选自基因敲除、基因插入和/或基因替换。6.利用权利要求1或2所述的适用于假单胞菌的基因组编辑系统敲除假单胞菌的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将λ
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Red和Cas9n元件整合到假单胞菌的基因组上：将PBBR1
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B质粒电转进入假单胞菌的感受态细胞；电转复苏后，转入含有木糖的LB培养基培养，涂5
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FOA筛选平板，得到基因组上的pyrF基因被Pmin::Cas9n
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PxylA::λ
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Red表达盒替换了的突变菌株；(2)构建pUCP18
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A质粒：以假单胞菌基因组DNA为模板，PCR扩增得到待敲除基因的上游同源臂、下游同源臂；将待敲除基因的上游同源臂、pyrF基因、下游同源臂、Ptrc启动子、编码“识别待敲除基因的gRNA”的DNA片段、Pvan启动子和编码gRNAp的DNA片段连接到pUCP18上，得到pUCP18
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A质粒；(3)将pUCP18
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A质粒电转进入步骤(1)所得突变菌株的感受态细胞，复苏后转移至含有木糖的LB培养基中，诱导...

【专利技术属性】
技术研发人员：林璐，李翔，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：