一种Treg扩增激活磁珠制备方法及其在Treg体外扩增中的应用技术

本发明专利技术提供了一种Treg扩增激活磁珠制备方法，具体包括以下内容：将CD3抗体和CD28抗体和IL2用磷酸盐缓冲液稀释，配置成缓冲液；计数1μm的羧基葡聚糖磁珠，并将装有磁珠悬液的离心管放置在磁铁上，使用移液器吸去磁珠上清；每108磁珠用1mL配置好的缓冲液重悬；将重悬后的磁珠放置于冰箱中，涡旋混匀，过夜；使用磷酸盐缓冲液和HSA配置终浓度为10％的HSA；第二天从冰箱中取出磁珠，在磁铁上弃取磁珠上清；使用与磁珠上清等量的10％HSA在37℃封闭羧基葡聚糖磁珠其余位点2小时。本方法避免了直接加入CD3/CD28抗体和细胞因子因为混合不均匀导致激活效率差，避免了提前一天预包被培养板的复杂操作。复杂操作。复杂操作。

【技术实现步骤摘要】
一种Treg扩增激活磁珠制备方法及其在Treg体外扩增中的应用


[0001]本专利技术涉及机体免疫
，具体为一种Treg扩增激活磁珠制备方法及其在Treg体外扩增中的应用。

技术介绍

[0002]调节T细胞(regulatory T cell，Treg)：是一群具有负调节机体免疫反应的淋巴细胞，通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用，但也参与肿瘤细胞逃避机体免疫监视和慢性感染。调节性T细胞具有免疫低下和免疫抑制两大特征，可“主动”的抑制效应细胞的活性，发挥免疫负向调节作用。
[0003]Treg的特征表面标志物为CD4，CD25和FoxP3。主要分为两类，一类是在胸腺中天然产生的CD4+CD25+Treg(nTreg)，主要依赖细胞
‑
细胞间接触发挥作用。另一类由CD4+CD25
‑
FOXP3
‑
T细胞诱导而来。
[0004]nTreg的分化依赖IL
‑
2，Treg细胞抑制自体免疫活性的确切过程，至今仍还一个待解之谜。这使得关于Treg细胞功能的研究，成为了一个经久不衰的热点课题。
[0005]大多数临床前研究的Tregs细胞产品来自外周血，主要分离方法是从外周血中分离单个核细胞，再通过免疫磁珠分选的方法获得Treg细胞，再在细胞培养液中添加CD3/CD28抗体或者包被了CD3/CD28抗体的磁珠，进行扩增后获得Treg。由于外周血中的Treg数量很少，仅占所有外周血CD4+细胞的5％
‑<br/>10％，免疫磁珠分选获得的Treg纯度不够，而CD3和CD28抗体除了能激活Treg扩增以外，也非常有利于效应CD25+T细胞的扩增，这可能会污染起始外周FOXP3+Treg细胞，使扩增后的细胞纯度下降。

技术实现思路

[0006]本专利技术所解决的技术问题在于提供一种Treg扩增激活磁珠制备方法及其在Treg体外扩增中的应用，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0007]本专利技术所解决的技术问题采用以下技术方案来实现一种Treg扩增激活磁珠制备方法，具体包括以下内容：
[0008](1)将CD3抗体和CD28抗体和IL2用磷酸盐缓冲液稀释，配置成含CD3 2ug/ml，CD28 1ug/ml，IL2 500ng/ml的缓冲液；
[0009](2)在显微镜下计数1μm的羧基葡聚糖磁珠，并将装有磁珠悬液的离心管放置在磁铁上，待磁珠吸附到管壁上时，使用移液器吸去磁珠上清；
[0010](3)每108磁珠用1mL配置好的缓冲液重悬；
[0011](4)将重悬后的磁珠放置于冰箱中，涡旋混匀，孵育过夜；
[0012](5)使用磷酸盐缓冲液和HSA(人血白蛋白)配置终浓度为10％的HSA；
[0013](6)第二天从冰箱中取出磁珠，在磁铁上弃取磁珠上清；
[0014](7)使用与磁珠上清等量的10％HSA在37℃封闭羧基葡聚糖磁珠其余位点2小时；
[0015](8)在含10％HSA的磷酸盐缓冲液中加入雷帕霉素；
[0016](9)获得Treg扩增激活磁珠，并保存于4℃的环境下。
[0017]优选地，所述(4)中的冰箱温度为4℃。
[0018]优选地，所述(8)中的雷帕霉素终浓度为200nM。
[0019]一种Treg扩增激活磁珠在Treg体外扩增中的应用，具体包括以下步骤：
[0020]步骤1、取50ml离心管，在离心管中加入20mL淋巴细胞分离液；
[0021]步骤2、将含有Treg的人外周血缓慢加到淋巴细胞分离液上层；
[0022]步骤3、400g，20min离心，关闭离心机刹车，离心结束后收集中间白膜细胞层；
[0023]步骤4、使用PBS重悬白膜细胞层，400g，10min离心洗涤，弃去上清，细胞沉淀即为含有Treg的PBMC；
[0024]步骤5、使用CD4+CD25+Regulatory T Cell Isolation Kit分离PBMC中的Treg；
[0025]步骤6、计数收获的Treg，使用含10％FBS的1640培养基将Treg细胞重悬至1million/mL；
[0026]步骤7、收获调整密度后的Treg细胞，按细胞：磁珠为3:1加入自制的CD3/CD28激活扩增磁珠，加入150nM雷帕霉素和150nM阿奇霉素放入37℃培养箱中培养；
[0027]步骤8、第七天对细胞进行换液处理，并在培养基中添加100ng/mL的IL
‑
2和150nM雷帕霉素和150nM阿奇霉素；
[0028]步骤9、之后每三天对细胞进行半量换液，并补加终浓度100ng/mL的IL
‑
2和150nM雷帕霉素和150nM阿奇霉素；
[0029]步骤10、第14天对细胞进行计数，计数后使用细胞筛对细胞过筛处理，使用磁铁将磁珠吸附下来后，对细胞换液处理，并按照磁珠：此时细胞量为3:1加入新的自制激活磁珠，并补加终浓度100ng/mL的IL
‑
2和150nM雷帕霉素和150nM阿奇霉素；
[0030]步骤11、每三天对细胞换液处理，并补加终浓度100ng/mL的IL
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2和150nM雷帕霉素和150nM阿奇霉素，到第24天时，收获细胞。
[0031]优选地，所述步骤10中的细胞筛为40μm细胞筛。
[0032]与已公开技术相比，本专利技术存在以下优点：本专利技术制备了一种专用的Treg激活扩增用磁珠，将调整后的一定浓度CD3/CD28抗体和IL
‑
2一起包被到直径1μm的羧基葡聚糖磁珠表面，能够使磁珠和细胞充分接触，混合更均匀，提高了激活效率。避免了直接加入CD3/CD28抗体和细胞因子因为混合不均匀导致激活效率差，也避免了提前一天预包被培养板的复杂操作。
[0033]Treg细胞直径大约5μm,磁珠比细胞小很多，本专利技术方法使用了1μm超小磁珠，在激活结束之后，使用磁铁吸附去磁珠时，能更快速更干净的将磁珠去除，避免了使用普通包被了CD3/CD28的磁珠激活Treg时，由于磁力不够，去磁珠时有残余，影响后续细胞功能。
[0034]本专利技术制备的Treg激活扩增磁珠不含叠氮化钠，对细胞的损伤小。本专利技术制备的Treg激活扩增磁珠使用人血白蛋白(HSA)替代了动物血清或人血清，维持了磁珠批次间稳定性。
[0035]雷帕霉素是一种可以特异性的激活Treg,但抑制其他T细胞生长的大环内酯类化合物，将雷帕霉素溶液作为Treg特异性激活磁珠的保存液，可以使Treg激活磁珠在激活扩增Treg的同时，抑制其他种类T细胞增殖，获得纯度更高的Treg细胞。
[0036]阿奇霉素也是一种大环内酯类化合物，可以增加Treg中的FOXP3+表达量，在整个扩增体系中添加阿奇霉素可以使得扩增后的Treg功能更好。
[0037]本专利技术方法调整了换液的频率以及额外添加了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Treg扩增激活磁珠制备方法，其特征在于：具体包括以下内容，(1)将CD3抗体和CD28抗体和IL2用磷酸盐缓冲液稀释，配置成含CD3 2ug/ml，CD28 1ug/ml，IL2 500ng/ml的缓冲液；(2)在显微镜下计数1μm的羧基葡聚糖磁珠，并将装有磁珠悬液的离心管放置在磁铁上，待磁珠吸附到管壁上时，使用移液器吸去磁珠上清；(3)每108磁珠用1mL配置好的缓冲液重悬；(4)将重悬后的磁珠放置于冰箱中，涡旋混匀，孵育过夜；(5)使用磷酸盐缓冲液和HSA(人血白蛋白)配置终浓度为10％的HSA；(6)第二天从冰箱中取出磁珠，在磁铁上弃取磁珠上清；(7)使用与磁珠上清等量的10％HSA在37℃封闭羧基葡聚糖磁珠其余位点2小时；(8)在含10％HSA的磷酸盐缓冲液中加入雷帕霉素；(9)获得Treg扩增激活磁珠，并保存于4℃的环境下。2.根据权利要求1所述的一种Treg扩增激活磁珠制备方法，其特征在于：所述(4)中的冰箱温度为4℃。3.根据权利要求1所述的一种Treg扩增激活磁珠制备方法，其特征在于：所述(8)中的雷帕霉素终浓度为200nM。4.一种Treg扩增激活磁珠在Treg体外扩增中的应用，具体包括以下步骤：步骤1、取50ml离心管，在离心管中加入20mL淋巴细胞分离液；步骤2、将含有Treg的人外周血缓慢加到淋巴细胞分离液上层；步骤3、400g，20min离心，关闭离心机刹车，离心结束后收集中间白膜细胞层；步骤4、使用PBS重悬白膜细胞层，400g，10min离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：周斌，余茂倩，黄欣，
申请(专利权)人：上海合佑生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：