一种现场快速检测水中铅离子的方法、试剂盒及其应用技术

本发明专利技术涉及一种现场快速检测水中铅离子的方法、试剂盒及其应用，属于重金属检测技术领域。本发明专利技术所述方法运用变构转录因子特异性识别铅离子的特性，具有灵敏度高和特异性强的特点。并且本发明专利技术体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，能够实现免仪器现场即时检测。实现免仪器现场即时检测。实现免仪器现场即时检测。

【技术实现步骤摘要】
一种现场快速检测水中铅离子的方法、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及重金属检测
，特别是涉及一种现场快速检测水中铅离子的方法、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]随着经济的快速发展和城市化进程的加快，我国水体中重金属污染问题日益严重。重金属污染由于其不可降解、易于生物富集，在水体中达到一定浓度就会对生态环境、动植物系统产生危害，最终将通过食物链直接或间接地危害人类健康。其中铅离子可以通过慢性蓄积作用对人体健康造成不可逆的损害，特别是对儿童的生长发育影响尤为严重。目前，铅的检测常用原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、色谱法等，这些检测方法都需要昂贵的仪器和复杂的操作，只能在实验室的条件下进行，不方便进行现场检测。
[0003]变构转录因子(allosteric transcription factor，aTF)是一类在细菌中广泛分布的调控蛋白，通常包含效应物感受结构域(EBD)和DNA结合结构域(DBD)两个结构域。小分子效应物通过与EBD结合使aTF的构象改变从而增强或减弱aTF与DNA的结合能力，进而调控基因的转录与表达。目前，还没有利用无细胞合成技术实现铅离子现场快速检测的相关记载。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种现场快速检测水中铅离子的方法，可显著提高水中铅离子检测的灵敏度和特异性。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种现场快速检测铅离子的方法，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系包括变构转录因子PbrR以及含有变构转录因子PbrR特异性识别序列的双链DNA，所述变构转录因子PbrR控制下游双链DNA中荧光基因的表达。
[0007]优选的，所述变构转录因子PbrR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]优选的，所述双链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]优选的，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、NTPs、TIPP、荧光染料以及T7 RNA聚合酶。
[0010]优选的，所述滴加的待测溶液与体外转录体系的体积比为1：10。
[0011]本专利技术还提供了一种现场快速检测铅离子的试剂盒，所述试剂盒中包括变构转录因子PbrR以及含有变构转录因子PbrR特异性识别序列的双链DNA，所述双链DNA的PbrR特异性识别位点下游含有荧光基因。
[0012]优选的，所述荧光基因为双链DNA中能够与荧光染料结合的基因片段。
[0013]优选的，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、NTPs、TIPP、荧光染料以及T7 RNA聚合酶。
[0014]优选的，所述缓冲液包括：Spermidine 20mM、Tris
‑
HCl 400mM、MgCl
2 80mM、NaCl 200mM和DTT 100mM。
[0015]本专利技术还提供了上述方法或上述的试剂盒在铅污染物检测中的应用。
[0016]本专利技术提供了一种现场快速检测水中铅离子的方法，以无细胞合成技术为基础，制备简单、反应条件温和的体外转录体系，该体系以能够特异性识别和结合铅离子的变构转录因子PbrR为控制元件，控制下游荧光基因的表达，产生绿色荧光。经验证，本专利技术所述方法具有灵敏度高和特异性强的特点，且体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，能够实现免仪器现场即时检测。
附图说明
[0017]图1为模板质粒pUC57图谱。
[0018]图2为PCR扩增产物纯化后测序结果图。
[0019]图3为检测体系反应10min的荧光强度结果图。
[0020]图4为铅离子浓度与相应荧光强度的回归曲线。
[0021]图5为其他重金属检测结果图。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种现场快速检测铅离子的方法，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系包括变构转录因子PbrR以及含有变构转录因子PbrR特异性识别序列的双链DNA，所述变构转录因子PbrR控制下游双链DNA中荧光基因的表达。
[0023]本专利技术中，所述变构转录因子PbrR是由145个氨基酸组成的蛋白质，所述PbrR的氨基酸序列为：MNIQIGELAKRTACPVVTIRFYEQEGLLPPPGRSRGNFRLYGEEHVERLQFIRHCRSLDMPLSDVRTLLSYRKRPDQDCGEVNMLLDEHIRQVESRIGALLELKHHLVELREACSGARPAQSCGILQGLSDCVCDTRGTTAHPSD(SEQ ID NO.1)。本专利技术中，所述变构转录因子PbrR能够特异性识别和结合铅离子，通过控制体外录体系中双链DNA下游荧光基团的表达，实现铅离子的检测。
[0024]本专利技术中，所述双链DNA的长度为332bp，其中含有变构转录因子PbrR特异性识别序列，所述双链DNA的核苷酸序列为：GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGATAATACGACTCACTATAGGAGGGTCTTGACTCTATAGTAACTAGAGGGTGTTAAATCCCACATACTCTGATGATCCGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATATTCGTATCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTATGTGGGTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG(SEQ ID NO.2)。
[0025]本专利技术中，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、NTPs、TIPP、荧光染料以及T7 RNA聚合酶。所述缓冲液包括终浓度为20mM的Spermidine、终浓度为400mM的Tris
‑
HCl、终浓度为80mM的MgCl2、终浓度为200mM的NaCl和终浓度为100mM的DTT。
[0026]本专利技术将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测。本专利技术中，所述待测溶液与体外转录体系孵育的体积比优选为1：10。本专利技术中，所述孵育的温度优选为35
‑
40℃，更优选为37℃；所述孵育的时间优选为5
‑
15min，更优选为10min。本专利技术中，所述荧光
检测优选为紫外检测，在紫外条件下，如有肉眼可见的绿色荧光产生说明待检溶液中含有铅离子。
[0027]本专利技术还提供了一种现场快速检测铅离子的试剂盒，所述试剂盒中包括变构转录因子PbrR以及含有变构转录因子PbrR特异性识别序列的双链DNA，所述双链DNA的PbrR特异性识别位点下游含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种现场快速检测铅离子的方法，其特征在于，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系包括变构转录因子PbrR以及含有变构转录因子PbrR特异性识别序列的双链DNA，所述变构转录因子PbrR控制下游双链DNA中荧光基因的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变构转录因子PbrR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、NTPs、TIPP、荧光染料以及T7 RNA聚合酶。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述滴加的待测溶液与体外转录体系的体积比为1：10。6.一种现场快速检测铅离子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：谌志强，薛斌，张永康，王景峰，邱志刚，王尚，李辰宇，赵辰，张曦，杨晓波，
申请(专利权)人：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，
类型：发明
国别省市：