一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。所述的鞭毛素突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术提供的鞭毛素截短突变体Fm能够高效上清表达，每升摇瓶培养及纯化后的蛋白产率可以达到40mg，易于放大及规模化生产，可以提高鞭毛素蛋白的广泛应用。将其与非洲猪瘟抗原蛋白融合后，在保持鞭毛素佐剂活性的同时，提高重组抗原的可溶性及表达水平，大大降低了表达及纯化工艺成本。大大降低了表达及纯化工艺成本。

【技术实现步骤摘要】
一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种鞭毛素突变体及其在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]通过鞭毛素蛋白与目的蛋白混合或融合后免疫，可以提高机体对抗原的免疫应答，其中鞭毛素融合或偶联抗原免疫效果更为显著【1】【2】，以鞭毛素为佐剂的核酸疫苗仅在实验室阶段研究，虽然不用经过蛋白纯化工艺，但是核酸疫苗本身面临着不可预知的安全风险和临床监管；目前很多致病菌的鞭毛素可能具有潜在的危险性和毒性，免疫动物后产生大量针对自身的抗体，导致可能的耐受性及炎症反应，这主要源于鞭毛素可变区的高免疫原性。沙门氏同种属的鞭毛素蛋白的氨基及羧基末端比较保守，从结构上可以分为保守的D0，D1,可变区D2和D3区；其中鞭毛素蛋白抗原性很强的区域位于D2和D3区，根据文献报道，外源抗原通常可以与鞭毛素羧基端连接或插入高可变区(I型鞭毛素174
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400位或201
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368位)，均保留了鞭毛素TLR5信号通路活性【3、4】。保守D0结构域由N端和C端两组α螺旋构成，C末端6个氨基酸VLSLLR形成疏水基序Motif，位于鞭毛素内核，亚基间的强疏水相互作用是参与鞭毛素组装的关键驱动力【5、6】。
[0003]近年来非洲猪瘟在国内外集约化养猪场的感染率和发病率日益提高，给养殖场带来巨大的经济损失。非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的以高热、皮肤发绀、淋巴及内脏器官严重出血为特征的急性、接触性传染病，一旦暴发，死亡率接近90
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100％。家猪和野猪是该病毒的自然宿主，感染后可终身带毒。ASFV是一种单股、两端共价连接的双链DNA病毒，具有二十面体结构，基因组全长约170kb～190kb，主要由4层组成：中央核仁、核衣壳、内层囊膜和二十面体的病毒衣壳，胞外病毒粒子，核衣壳具有双层囊膜。
[0004]研究表明，非洲猪瘟p54、p30等结构蛋白在病毒入侵，衣壳组装上起到重要作用【7、8】以这些蛋白为靶标的核酸疫苗及活载体疫苗均能一定程度上抑制非洲猪瘟在肺泡巨噬细胞(PAM)上的复制和增殖，降低带毒量，延缓病情的发作。非洲猪瘟病毒的传播途径主要为粪口传播，在唾液和扁桃体的分离率很高。因此，提高粘膜免疫对于非洲猪瘟的防控具有积极意义。
[0005]因此本专利技术对肠道沙门氏菌鞭毛素(WP_050188722)进行设计突变，与非洲猪瘟抗原融合表达，以期提高免疫猪群对靶抗原的黏膜免疫效果。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种鞭毛素突变体，所述的鞭毛素突变体，该突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。该突变体在降低鞭毛素抗原区免疫引起的副反应的同时，能够维持鞭毛素的佐剂活性。
[0007]本专利技术的另一个目的在于提供鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：
[0009]申请人以肠道沙门氏菌鞭毛素(WP_050188722)为来源，以蛋白结构数据库5A3X主题骨架为模板，通过分子动力学模拟设计，保留了部分可变区的连接区，以最短的Linker序列GSGPGG替换了鞭毛素抗原可变区178～320位氨基酸(图1)，该鞭毛素突变体的预测自由能最小；同时去除了C末端促进鞭毛素亚基组装的6个氨基酸VLSLLR，以防止标签序列的包裹，提高鞭毛素蛋白的纯化效率；整个突变体在降低鞭毛素抗原区免疫引起的副反应的同时，能够维持鞭毛素的佐剂活性。获得的突变体Fm的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，编码该突变体的核苷酸为SEQ ID NO.3所示。
[0010]所述鞭毛素突变体可融合的促溶标签包括MBP、GST、NusA、TrxA、Sumo、Fh8、Msyb或Gb1；
[0011]优选的为：TrxA、Sumo及Msyb。
[0012]本专利技术的保护范围包括：鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。
[0013]优选的，是将鞭毛素突变体与非洲猪瘟P54或P30蛋白进行融合表达。
[0014]优选地，制备的融合蛋白Fm
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p54的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示，Fm
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p30的氨基酸序列为SEQ ID NO.13所示。
[0015]本专利技术的保护范围还包括：重组融合蛋白Fm
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p54、Fm
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p30在制备预防非洲猪瘟病毒感染的重组亚单位疫苗中的应用，包括利用本领域的常规方式，包括但不限于利用上述技术制备的融合蛋白，用于制备预防非洲猪瘟病毒感染的重组亚单位疫苗。
[0016]与现有技术相比，本专利技术的有益效果：
[0017]1.本专利技术提供的鞭毛素截短突变体Fm能够高效上清表达，融合标签的鞭毛素突变体Fm上清表达量高达50～100mg/L，与镍柱结合的效果最好，上清中的目的蛋白大部分与镍柱结合，洗脱回收率超过90％，蛋白纯度高于90％，每升摇瓶培养及纯化后的蛋白产率可以达到40mg，易于放大及规模化生产，可以提高鞭毛素蛋白的广泛应用。
[0018]2.本专利技术构建了3种标签的鞭毛素突变体的重组载体，不同标签融合的鞭毛素突变体均在上清高效表达。这些载体能够广泛用于重组亚单位疫苗的表达，在保持鞭毛素佐剂活性的同时，提高重组抗原的可溶性及表达水平，大大降低了表达及纯化工艺成本。
[0019]3.由于所构建的鞭毛素突变体能够在上清中高效表达，融合后有助于p30、p54的上清表达。
[0020]4.本专利技术将非洲猪瘟保护性抗原与鞭毛素突变体融合，能够大量表达和制备。虽然p54、p30抗原的自身免疫原性具有差异，但是融合鞭毛素后，均可以显著提高抗原p54、p30的黏膜免疫水平；所述方法易于融合非瘟其它抗原，具有很强的扩展性。
附图说明
[0021]图1为Flagellin突变体(A所示)及抗原(Ant)融合构建(B所示)示意图。
[0022]图2：Flagellin全长及突变体片段扩增及载体回收核酸电泳图；
[0023]其中泳道1：Flagellin全长；2：Fm扩增片段；3：Fm
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C6扩增片段；4：pET30t酶切回收骨架。
[0024]图3为pET30t
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flagellin(全长)纯化SDS
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PAGE图；
[0025]其中泳道1：Fla诱导表达上清液；2：Fla过NTA镍柱流穿液；3：Fla样品50mM咪唑洗涤收集4：Fla样品250mM咪唑洗脱收集。
[0026]图4为pET30t
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Fm
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C6纯化的SDS
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PAGE图；
[0027]其中泳道1：Fm
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C6诱导表达上清液；2：Fm
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工合成的鞭毛素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。2.权利要求1所述的鞭毛素突变体在制备非洲猪瘟抗原融合蛋白中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，所述融合蛋白的促融标签为TrxA、Sumo或Msyb。4.根据权利要求2所述的应用，是将鞭毛素突变体与非洲...

【专利技术属性】
技术研发人员：金梅林，邹忠，左文峰，康超，杨于，尚霄敏，黎晶晶，杨丽，孙小美，何兴林，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：