一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。本发明专利技术得到的增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。此外，谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，是最常用的蛋白表达的稳定多肽，但对不同目标蛋白效果差异大。本发明专利技术鉴定出的SspH1前导稳定元件可以提供一个新的选择，以获得理想的活性蛋白的表达。白的表达。白的表达。

【技术实现步骤摘要】
一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件


[0001]本专利技术属于生物
，具体为一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。

技术介绍

[0002]在科学研究和生物医药工业生产和抗传染病疫苗制备中，常常需要在原核细菌中(包括但不限于大肠杆菌，沙门氏菌，志贺氏菌，结核分枝杆菌等)表达或者纯化有生物活性的蛋白。
[0003]但目前在细菌中表达外源蛋白经常遇到下列问题：
[0004](1)无产量或低产量。目标蛋白无法通过敏感技术(例如Western印迹)检测到或被检测到。含量很低(每升培养物低于微克)时，问题通常在于异源蛋白发挥有害作用或者蛋白本身不稳定。
[0005](2)蛋白质失活。获得大量的可溶性蛋白质并不是最终目标。这种蛋白质可能仍然质量不佳，即，它没有应有的活力。
[0006]因此如何增强细菌中蛋白的活性和表达一直是一个需要解决的重要问题。

技术实现思路

[0007]针对上述问题本专利技术提供了一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。
[0008]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0009]一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，包含可变N端区域，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。
[0010]一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0011]步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子(265个核苷酸)和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列(含有翻译起始密码子，编码208个氨基酸残基的前导多肽，也就是T3SS区)。
[0012]步骤2，将步骤1克隆得到的SspH1基因的最小启动子和其N端208个氨基酸残基的编码序列通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到酶切位点修饰过的pGL3
‑
Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到重组质粒。在这个重组质粒中，SspH1的前导多肽编码区和荧光素酶编码区同框，以表达SspH1前导多肽
‑
荧光素酶融合蛋白。
[0013]步骤3，将得到的重组质粒分别转染到大肠杆菌E.coli C2566中，在LB肉汤培养基中培养12个小时，收获细胞并裂解，使用发光计Lumat LB9507测量细胞裂解物中的相对萤光素酶活性，从而鉴定出增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件。因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比，测定荧光素酶的活性变化可以同时反应其表达量的变
化。
[0014]进一步，所述步骤1中沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子的核苷酸序列如SEQ.ID.NO：3所示。
[0015]进一步，所述步骤1中克隆所用的引物对序列如SEQ.ID.NO：4和SEQ.ID.NO：5所示；PCR克隆的反应条件为：95℃ 2min；35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；72℃ 5min。
[0016]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0017]1、本专利技术利用的沙门氏菌SspH1基因的最小启动子，在大肠杆菌中依然保持活性，是一个有普遍活性的启动子，有潜力应用到其它不同种的原核细菌中。
[0018]2、谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白，是最常用的蛋白表达的稳定多肽，但对不同目标蛋白效果差异大。本专利技术鉴定出的SspH1前导稳定元件可以提供一个新的选择，以获得理想的活性蛋白的表达。
[0019]3、本专利技术得到的前导稳定元件能显著增强外源蛋白(荧光素酶)在细菌中的表达和活性，可以在工业界或科研中把它用作一个提升蛋白产量和蛋白活力的工具，有助于科学研究和生物医药工业生产以及抗传染病疫苗制备。
附图说明
[0020]图1为SspH1基因的最小启动子DNA序列和SspH1蛋白N端208个氨基酸的编码DNA序列。TS表示潜在转录起始位点。
[0021]图2为SspH1蛋白N端208个氨基酸序列。
[0022]图3为实施例构建的不同重组质粒的结构图，箭头代表转录起始位点和方向。
[0023]图4为实施例构建的不同重组质粒中荧光素酶的活性，图中*代表P<0.01。
具体实施方式
[0024]下面结合本专利技术实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本专利技术的保护范围。
[0025]因为荧光素酶的活性和荧光素酶的表达量成正比，测定荧光素酶的活性变化可以同时反应其表达量的变化，因此下列实施例通过测荧光素酶的活性来展现其在大肠杆菌中的活性与表达。
[0026]实施例
[0027]一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，包含可变N端区域，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示，氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。
[0028]增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件的鉴定：
[0029]1、克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1的最小启动子(SEQ.ID.NO：3)和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列(共计889个核苷酸序列，见图1所示)；
[0030]根据沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672染色体序列(GenBank序列号：
CP047323.1)中的SspH1基因编码区设计引物对pSspH1
‑
265
‑
F/pSspH1
‑
R2，用引物对pSspH1
‑
265
‑
F/pSspH1
‑
R2，细菌基因组DNA和高保真Tag DNA聚合酶建立聚合酶链式反应(PCR)，反应条件为95℃ 2min，然后是35个循环的95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min；最后是72℃ 5min。PCR产生的0.9kb DNA条带用琼脂糖凝胶电泳纯化。
[0031]引物序列如下：(下划线为酶切位点)
[0032]pSspH1
‑
265
‑
F(SEQ.ID.NO：4)：
[0033]5’‑
GGCCTCGAGCCATCAGGGAAAAATGTGCT
‑3’
[0034]pSspH1
‑
R2(SEQ.ID.NO：5)：
[0035]5’‑
GGCGCGGCCGCGGTAAGACCTGAC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，其特征在于：所述前导稳定元件为沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1蛋白N端的208个氨基酸残基片段，包含可变N端区域，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO：1所示。2.一种增强细菌中外源蛋白活性和表达的前导稳定元件，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，PCR克隆沙门氏菌肠亚种肠衣原体鼠伤寒菌株RM13672 SspH1基因的最小启动子和SspH1蛋白N端208个氨基酸残基的编码序列；步骤2，将步骤1克隆得到的SspH1的最小启动子和其N端208个氨基酸残基的编码序列通过XhoI/NotI限制酶酶切连接到酶切位点修饰过的pGL3
‑
Basic质粒的荧光素酶编码区上游，得到重组质粒；步骤3，将得到的重组质粒转染到大肠杆菌E.coli...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢力，潘元晴，吴长新，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：